羅燕，趙宗勝，谷新利，邵永斌，時(shí)敏

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）是存在于肌外膜、肌束膜或肌內(nèi)膜上的脂肪，營(yíng)養(yǎng)狀況好的家畜，其肌纖維膜的毛細(xì)血管上也有脂肪沉積。研究發(fā)現(xiàn)，畜禽IMF含量、比例和分布狀況，與肌肉的多汁性、嫩度、肉色、大理石紋以及肌肉pH值等肉品評(píng)價(jià)指標(biāo)都有很強(qiáng)的相關(guān)性［1］，是影響動(dòng)物肉品質(zhì)和風(fēng)味的決定因素之一。近年來(lái)，如何在不影響動(dòng)物生長(zhǎng)、并保持整體脂肪率較低的情況下，適當(dāng)提高肌內(nèi)脂肪含量以提高肉品質(zhì)，已經(jīng)成為當(dāng)前相關(guān)畜牧生產(chǎn)面臨的一個(gè)重要課題，而對(duì)于作為肌內(nèi)脂肪組織的基本單元——前體脂肪細(xì)胞的增值分化能力及其影響因素的研究，具有非常重要的意義。

前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)不僅能完整地認(rèn)識(shí)脂肪組織發(fā)生和增生的全過(guò)程，并且可以直接觀察各種因素對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)控。目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立了豬［2－3］、牛［4－5］前體脂肪細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)模型，取材部位有皮下、肌內(nèi)和網(wǎng)膜脂肪組織等，但目前有關(guān)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立還未見報(bào)道。

“君子文化不僅是傳統(tǒng)文化的一個(gè)重要制高點(diǎn)，還是一個(gè)關(guān)鍵融匯點(diǎn)。”[1]118-124 君子文化豐富博大，其內(nèi)蘊(yùn)前人學(xué)者多有闡發(fā)，諸如仁義禮智信、忠孝節(jié)義等特質(zhì)早已納入并根植中華民族的文化心理與民族精神之中。 注杜是一種民族心理的體現(xiàn)，這種民族心理外化表現(xiàn)出諸多形式，其核心正是儒家君子文化。 子曰：“質(zhì)勝文則野，文勝質(zhì)則史。 文質(zhì)彬彬，然后君子?！?《論語(yǔ)·雍也》)杜詩(shī)文質(zhì)兼?zhèn)洌粌H蘊(yùn)含著高超的文學(xué)藝術(shù)價(jià)值，也融匯了儒家傳統(tǒng)文化精髓。 君子文化在這一時(shí)期文人注杜中的表現(xiàn)方式大致可以梳理出以下幾個(gè)方面。

本實(shí)驗(yàn)旨在摸索建立綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式，為后續(xù)通過(guò)反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控（如營(yíng)養(yǎng)素等）手段調(diào)控肌內(nèi)脂肪的發(fā)育、肌內(nèi)脂肪沉積機(jī)制的研究提供一種簡(jiǎn)便有效的細(xì)胞模型，旨在為今后改善本地綿羊肌內(nèi)脂肪含量、改善羊肉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 組織來(lái)源

將密度為1×105個(gè)／mL的細(xì)胞懸液等量接種至24孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為10組，每組3孔。完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞接觸抑制，換用分化培養(yǎng)液（記作第0天），之后每天取出3孔細(xì)胞測(cè)定脂肪含量，直至第10天結(jié)束。測(cè)定時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS涮洗2次，10%中性甲醛溶液固定30min，蒸餾水漂洗2次，油紅O工作液浸染2h，蒸餾水漂洗數(shù)次，烘干水分后加入1mL異丙醇進(jìn)行萃取，吸出萃取液，于722型分光光度計(jì)510nm處測(cè)定吸光度。

1．1．2 主要試劑配置和儀器

1．2．4．2 前體脂肪細(xì)胞的油紅O染色法鑒定

1．2 方法

1．2．1 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)［4］

例2：...there was laughter fromunheard jokes,and lighted cig-arettesmade unintelligible circles inside.

1．2．1．1 組織塊培養(yǎng)法

1．2．4．3 前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量測(cè)定

1．2．1．2 單層細(xì)胞培養(yǎng)法

4K指分辨率達(dá)到3840×2160，8K指分辨率達(dá)到7680×4320。以往舊型號(hào)電視機(jī)多以720P高清（1280×720）分辨率為標(biāo)準(zhǔn)，其后1080P全高清（1920×1080）盛行。

取材及洗滌同組織塊培養(yǎng)法；將0．5～1．0mm3的組織小塊移入離心管中，含雙抗的PBS漂洗數(shù)次，加入5倍體積的1mg／mLⅠ型膠原酶消化液，密封管口，置于37℃恒溫水浴箱中消化1h（每隔3 min搖動(dòng)1次）；加入完全培養(yǎng)基終止消化，不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，收集濾液于另一離心管中，1000r／min，8min；細(xì)胞沉淀經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗2次，完全培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液；計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1．0×105個(gè)／mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24h后換液以除去血細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞，之后每隔2～3d換液1次。

1．2．2 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)［5］

目前包括3G/4G/5G在內(nèi)的陸上移動(dòng)通信技術(shù)應(yīng)用廣泛。3G的通信速率一般約為2 Mbit/s，而4G/5G的傳輸速率更優(yōu)于3G技術(shù)。如果3G/4G/5G移動(dòng)通信技術(shù)能夠在近岸條件下的船岸通信中得以應(yīng)用，將極大地提高數(shù)據(jù)傳輸速率，使近岸船舶獲得實(shí)時(shí)航行安全信息成為可能。

原代細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%匯合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS涮洗2遍，0．25%胰蛋白酶消化液在37℃下消化2～3min，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)回縮并有個(gè)別細(xì)胞飄起時(shí)，棄去消化液，加入完全培養(yǎng)液終止消化，吹打成細(xì)胞懸液，按1∶3或1∶4的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，標(biāo)記為P1（第1代）。傳代培養(yǎng)過(guò)程中，每2～3d換1次完全培養(yǎng)液，直至細(xì)胞匯合并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，再重復(fù)上述操作繼續(xù)傳代。

四個(gè)人面面相覷。上官星雨捏著玉玦，將頭伸進(jìn)缺口。缺口之下，三五尺之深，水面如鏡，映照出花容月貌的女孩兒自己。對(duì)，那就是她，跟之前在黃河岸邊看到的一臉泥炭的乞丐不同，她的剪剪秋水，漆黑頭發(fā)，海棠般的臉，明亮俏麗，這花瓣雨的洗濯，又讓她回到上官家小姐的樣子。

原代細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%匯合時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶消化、洗滌后收集細(xì)胞，按每孔5．0×104個(gè)細(xì)胞等量接種至2個(gè)24孔培養(yǎng)板內(nèi)，隨機(jī)分為10組，每組3孔。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，記作第0天，以后每天取3孔細(xì)胞消化，每孔計(jì)數(shù)3次，結(jié)果以3孔的細(xì)胞均數(shù)表示，如此至第10組結(jié)束。

1．2．4 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與初步鑒定［7］

將密度為1×105個(gè)／mL的細(xì)胞懸液等量接種至事先鋪有無(wú)菌蓋玻片的培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞接觸抑制，換用分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化（記作第0天），之后每2d換液1次，直至第10天。

1．2．4．1 前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

由表4可以看出，施用腐殖酸螯合肥后單果重、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑及可溶性固形物都有明顯增加，處理1較處理2單果重增加了5 g、果實(shí)橫徑增加了0.7 cm、果實(shí)縱徑增加0.9 cm、可溶性固形物增加2.1%；處理1較處理3單果重增加了12 g、果實(shí)橫徑增加了0.6 cm、果實(shí)縱徑增加1.3 cm、可溶性固形物增加1.4%。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM／F12培養(yǎng)粉1袋（GIBCO，12500－062），2．438g NaHCO3，滅菌超純水定容至1000mL。完全培養(yǎng)基：90mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10 mL胎牛血清（GIBCO，743794），青、鏈霉素終濃度均為100U／mL。分化培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為10μg／mL 胰島素（INS，Sigma，I5500），1．0μmol／L 地塞米松（DEX，Sigma，D1756），0．5 mmol／L 3－異 丁 基－1－甲 基 黃 嘌 呤 （IBMX，Sigma，17018）。1mg／mLⅠ型膠原酶消化液：25mgⅠ型膠原酶（Sigma，C0130），0．25g牛血清白蛋白，25 mL PBS溶解。0．25%胰蛋白酶消化液：0．25g胰蛋白酶（Sigma，1∶250）溶于100mL PBS中。上述溶液均需調(diào)整pH值至7．2～7．4，0．22μm微孔濾膜正壓過(guò)濾除菌，分裝后置于－20℃保存。油紅O工作液：0．7g油紅O，溶于200mL異丙醇中，室溫靜置過(guò)夜，分析濾紙過(guò)濾，濾液加入150mL滅菌蒸餾水，4℃靜置過(guò)夜，過(guò)濾2次后室溫儲(chǔ)存。DKZ－2型恒溫水浴箱（上海精安實(shí)驗(yàn)儀器廠）；FORMA3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；LeicaDMI3000M型倒置顯微鏡（浙江省科學(xué)器材進(jìn)出口有限責(zé)任公司）；722型分光光度計(jì)（上海市光棱技術(shù)有限公司）。

紅軍在進(jìn)入川西北地區(qū)之初，就這樣爭(zhēng)取少數(shù)民族的支持并使之投身革命斗爭(zhēng)，從封建壓迫下解放出來(lái)的問(wèn)題，進(jìn)行了仔細(xì)的研究，顯示出中央對(duì)這一問(wèn)題的極大關(guān)注，意識(shí)到了群眾工作的重要性。

取出上述爬滿細(xì)胞的蓋玻片，PBS漂洗2次，10%中性甲醛固定30min，蒸餾水漂洗2次，油紅O浸染2h，蒸餾水漂洗數(shù)次，蘇木精復(fù)染5min，自來(lái)水沖洗，干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察脂滴著色情況。

1．2．3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定［6］

脂肪組織用PBS（含青霉素、鏈霉素各400U／mL）漂洗5次，仔細(xì)剔除血管和結(jié)締組織，剪成0．5～1．0mm3的小塊，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入少量完全培養(yǎng)液懸浮組織小塊；用吸管分次吸取組織塊，將其均勻貼附于培養(yǎng)皿底壁上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中約4h，待組織塊牢固粘附于培養(yǎng)皿底壁后，加適量完全培養(yǎng)液浸泡組織塊，靜置培養(yǎng)3d；3 d后補(bǔ)加或更換培養(yǎng)液，并吸出漂浮的組織塊；之后每隔2d換液1次。

于石河子市活畜屠宰場(chǎng)選取健康綿羊1只，快速無(wú)菌分離肌內(nèi)脂肪組織，放入預(yù)先備好的含雙抗（青、鏈霉素各400U／mL）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，帶回實(shí)驗(yàn)室。

2 結(jié)果

2．1 形態(tài)學(xué)觀察

2．1．1 組織塊培養(yǎng)法

組織塊經(jīng)貼壁培養(yǎng)4～5d后，其邊緣可見游離出少量梭形或不規(guī)則形的成纖維樣細(xì)胞（圖1a）。8～9d后有多量細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)（圖1b）。14～15d可形成單層匯合，細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀或漩渦狀生長(zhǎng)；隨著細(xì)胞密度增加，有少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等的微小脂滴（圖1c中箭頭所指）。當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大時(shí)，甚至出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)和代謝物等因素，出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，少量細(xì)胞開始脫落。

《支持計(jì)劃》圍繞鄉(xiāng)村教師“下不去、留不住、教不好”三個(gè)核心問(wèn)題，從鄉(xiāng)村教師師德水平、補(bǔ)充渠道、生活待遇、編制標(biāo)準(zhǔn)、職稱評(píng)聘、交流制度、能力素質(zhì)和榮譽(yù)制度等八個(gè)方面開始全方位、立體化地解決鄉(xiāng)村教師隊(duì)伍建設(shè)中面臨的突出問(wèn)題?；诖?，通過(guò)對(duì)2 888名鄉(xiāng)村教師開展研究分析，以期從《支持計(jì)劃》的八大方面進(jìn)行深入探析鄉(xiāng)村教師生存狀態(tài)。

圖1 組織塊法培養(yǎng)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞（200×）Fig．1Culture of ovine intramuscular preadipocyte by means of explant techniques（200×）

2．1．2 單層細(xì)胞培養(yǎng)法

經(jīng)I型膠原酶消化獲取的脂肪細(xì)胞，剛接種時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，為小圓球形，呈懸浮狀態(tài)（圖2a）；2～3 h后，有少量細(xì)胞貼壁呈小三角形（圖2b）；24h后多數(shù)細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞伸展變形，呈長(zhǎng)梭形或星形；第3天起，細(xì)胞生長(zhǎng)加速，梭形和不規(guī)則形細(xì)胞大量增加（圖2c）；至第7天，細(xì)胞可形成單層匯合，可進(jìn)行傳代。形成單層匯合后，亦有少數(shù)細(xì)胞自發(fā)分化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)反光小滴。

圖2 單層細(xì)胞法培養(yǎng)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞（200×）Fig．2Culture of ovine intramuscular preadipocyte by means of monolayer culture method（200×）

2．2 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，需在顯微鏡下時(shí)刻觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待大量細(xì)胞形態(tài)回縮變圓、個(gè)別細(xì)胞飄起時(shí)（圖3），應(yīng)立即終止消化，以免消化太過(guò)，對(duì)細(xì)胞造成損傷。第1次傳代（接種細(xì)胞密度1．0×105個(gè)／mL）后，前脂肪細(xì)胞仍為梭形，均勻分散分布于整個(gè)培養(yǎng)瓶底部，其形態(tài)、大小一致，增殖迅速。一般2～3d即可形成單層匯合，細(xì)胞的形態(tài)及其生長(zhǎng)情況、脂肪積聚情況基本與原代培養(yǎng)一致。

圖3 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化時(shí)的形態(tài)變化Fig．3Morphology of cells digested by trypsin

2．3 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

在接種密度為5×104個(gè)／mL條件下，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。根據(jù)司徒鎮(zhèn)強(qiáng)等［6］關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞倍增時(shí)間的計(jì)算公式，得出綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的倍增時(shí)間為62h（圖4）。從圖4可以看出，綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線類似S型，符合體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)增殖規(guī)律，即先進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)的潛伏期（約38h），隨后到指數(shù)生長(zhǎng)期（第2～6天），最后達(dá)到生長(zhǎng)停止的平臺(tái)期（第7天后）。第9天，因細(xì)胞密度過(guò)大，受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)和代謝產(chǎn)物干擾，少數(shù)細(xì)胞脫落死亡。

圖4 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig．4Gowth curve of intramuscular preadipocytes cultured in vitro

2．4 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及油紅O染色鑒定

細(xì)胞增殖與細(xì)胞分化是相互制約的2個(gè)過(guò)程，前體脂肪細(xì)胞在未使用誘導(dǎo)劑前，以增殖為主，而經(jīng)INS＋DEX＋I(xiàn)BMX誘導(dǎo)后快速進(jìn)入分化成熟階段。實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)分化第2天，有少量細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等散在的小脂滴；第4天，多脂滴細(xì)胞明顯增多（圖5a）；第8～10天，部分小脂滴開始匯合成大脂滴（圖5b）。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，經(jīng)油紅O染色法鑒定，脂滴被親脂的油紅O著色而成橘紅色，細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色，證明該細(xì)胞是脂肪細(xì)胞（圖5c）。

圖5 脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及分化鑒定（200×）Fig．5Induce differentiation and identification of intramuscular preadipocyte

2．5 前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量測(cè)定

測(cè)定結(jié)果見圖6。

由圖6可知，前體脂肪細(xì)胞經(jīng)INS＋DEX＋I(xiàn)BMX誘導(dǎo)分化后，于第2天少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)散在脂滴；第4天開始，隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)脂肪含量持續(xù)增加；脂肪含量的測(cè)定結(jié)果與誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂肪形成的形態(tài)學(xué)變化完全吻合。

圖6 前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的變化Fig．6Cytoplasmic fat content changes in preadipocyte differentiation

3 討論

1）本研究采用組織塊法和Ⅰ型膠原酶消化法均獲得了成分均一、增殖和分化旺盛的梭形細(xì)胞。通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：組織塊培養(yǎng)法操作步驟簡(jiǎn)便、成功率高且細(xì)胞同源性好，缺點(diǎn)在于原代培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)（約15d），得到的細(xì)胞數(shù)量較少；而I型膠原酶消化法只需5～6d即可達(dá)到80%匯合，適于短期內(nèi)獲得大量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，其缺點(diǎn)在于有其他種類細(xì)胞混雜，污染率較高，但通過(guò)嚴(yán)格控制操作可減少污染，通過(guò)細(xì)胞傳代可純化細(xì)胞。故本實(shí)驗(yàn)后續(xù)培養(yǎng)均采用消化法培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與豬［3］、牛［4］、人［8］、大鼠［9］等的前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)條件基本一致。另有文獻(xiàn)［10］指出，隨著不斷傳代及細(xì)胞生存環(huán)境的變化，細(xì)胞的生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生改變，增殖和分化能力會(huì)不斷下降，故本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究均采用2代以內(nèi)的前體脂肪細(xì)胞。

結(jié)合表5、表6可知堿劑在25 g/L質(zhì)量濃度是最好的，在堿劑質(zhì)量濃度25 g/L的情況下，再確定棉條的最佳染色溫度。染色溫度對(duì)染料的吸附有影響，一般染色溫度低，染色時(shí)間更長(zhǎng)，可以提高棉條的染色深度。然而在實(shí)際染色中要考慮經(jīng)濟(jì)性，所以有必要設(shè)定合理的染色溫度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變?nèi)旧珳囟?，研究不同染色溫?（40℃，50℃，60℃，70℃，80℃）對(duì)棉條染色深度的影響。染色工藝見表7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

2）細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律的重要表現(xiàn)，每一代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程可分為潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期和抑制期。需要注意的是，潛伏期的長(zhǎng)短與接種的細(xì)胞密度有關(guān)，細(xì)胞數(shù)過(guò)少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；而細(xì)胞密度越大，潛伏期就越短，更導(dǎo)致細(xì)胞提早進(jìn)入生長(zhǎng)抑制階段。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不斷摸索，認(rèn)為24孔板每孔接種5．0×104個(gè)細(xì)胞、接種后24h進(jìn)行首次換液能得到較好的結(jié)果。細(xì)胞經(jīng)歷38h的潛伏期后，于第2天開始迅速增殖，第7天時(shí)增殖速度逐漸下降進(jìn)入平臺(tái)期，第9天由于細(xì)胞密度增大，代謝產(chǎn)物增加，部分細(xì)胞脫落死亡，進(jìn)入抑制期，其生長(zhǎng)曲線近似S型，符合細(xì)胞的正常生長(zhǎng)增殖規(guī)律。

3）本實(shí)驗(yàn)中的脂肪組織來(lái)源于成年雌性綿羊的肌肉內(nèi)，分離得到的前體脂肪細(xì)胞在胰島素和地塞米松的誘導(dǎo)下能分化為成熟脂肪細(xì)胞，說(shuō)明在成年動(dòng)物中確實(shí)存在具有分化能力的前體脂肪細(xì)胞，這與Yagi等［11］的結(jié)果相一致等。原代培養(yǎng)中，在不外加胰島素和地塞米松的情況下，發(fā)現(xiàn)少部分細(xì)胞能自動(dòng)分化為成熟脂肪細(xì)胞，而在傳代培養(yǎng)中則必須有胰島素和地塞米松的誘導(dǎo)。這可能是因?yàn)楸狙芯恐械闹緣K來(lái)源于成年個(gè)體的成熟脂肪組織，前脂肪細(xì)胞在體內(nèi)已經(jīng)被激活，或是本身分離獲得的前脂肪細(xì)胞中就存在一定數(shù)量的成熟脂肪細(xì)胞，故可觀察到這種活躍的脂肪細(xì)胞新生。

在當(dāng)前時(shí)代背景下，各行各業(yè)的發(fā)展都離不開制度的規(guī)范，我國(guó)土木工程行業(yè)也不例外，對(duì)于土木工程施工管理工作，施工管理制度可以為土木工程項(xiàng)目的整體施工質(zhì)量管理工作提供基礎(chǔ)保障，因此，只有在健全的管理制度下，才能保證管理工作的順利進(jìn)行。但就我國(guó)目前土木工程施工管理工作的實(shí)際情況，大部分施工單位都在應(yīng)用傳統(tǒng)的管理制度以及管理規(guī)范，由于這些管理制度的落后，無(wú)法滿足當(dāng)前管理工作的實(shí)際需要，且內(nèi)容不夠全面，對(duì)工程管理工作中的一些細(xì)節(jié)無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)管理，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)施工工作的順利進(jìn)行起到了阻礙作用。

4）油紅O是一種能與細(xì)胞內(nèi)甘油三酯特異性結(jié)合而使其著橘紅色的染料，其準(zhǔn)確性和敏感性與測(cè)定前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的標(biāo)志酶GPDH相似，因此常用作體外培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞的鑒定、分化狀態(tài)的觀察和分化程度的定量分析［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原代培養(yǎng)細(xì)胞在80%匯合后、傳代細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)反光小滴，經(jīng)油紅O染色后呈紅色，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。而且，細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后開始有脂肪積聚，4d后積聚量迅速增加，與誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂肪形成的形態(tài)學(xué)變化完全吻合。

綜上所述，通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和研究分析證明，本研究成功建立了綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式，探索了其生長(zhǎng)、增殖及分化的生物學(xué)特征，可為后續(xù)開展綿羊肌內(nèi)脂肪發(fā)育與沉積機(jī)制及改善羊肉品質(zhì)和風(fēng)味等研究奠定基礎(chǔ)。

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