朱新霞，艾尼江，閆潔，趙海

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)院，石河子832000；2新疆石河子棉花所，石河子832000）

棉花（Gossypiumspp．）組織中富含多糖、脂類以及多酚、色素等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)在DNA和RNA提取過(guò)程中較難以去除干凈，其以不同方式干擾DNA和RNA的提取。目前應(yīng)用于棉花總DNA提取的方法主要有SDS法、CTAB法、PVP40法、氯仿－異戊醇法、β－巰基乙醇法、改良Trizol法以及 DNA 提取試劑盒［1－5］，應(yīng)用于棉花總 RNA 提 取的方法主要有異硫氰酸胍法、冷酚法、SDS／酸酚法、高鹽高pH值提取法、CTAB／酸酚法、RNA提取試劑盒［6－10］，這些方法（除試劑盒）雖能提取出棉花的DNA或RNA，但提取步驟比較繁雜，所耗試劑較多、提取周期比較長(zhǎng)，有的甚至還需要2d。試劑盒相比而言操作簡(jiǎn)便、能快速提取棉花組織的DNA或RNA，但產(chǎn)率低且價(jià)格昂貴，提取成本較高，對(duì)于樣品數(shù)量較少的樣本和樣品種類較多的實(shí)驗(yàn)材料局限性較大。

為節(jié)約樣品數(shù)量、降低成本、簡(jiǎn)捷快速地提取棉花DNA與RNA，本實(shí)驗(yàn)以棉花幼苗為試材，通過(guò)對(duì)棉花基因組DNA或RNA提取方法的比較分析，針對(duì)棉花富含酚類、多糖、單寧等次生物質(zhì)的特點(diǎn)，借鑒前人提取DNA和RNA的方法，通過(guò)改進(jìn)常規(guī)試劑CTAB法提取程序和相關(guān)技術(shù)參數(shù)，摸索出一套簡(jiǎn)便、快速、低成本的高純度棉花DNA和RNA同步提取的方法，以期為棉花分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗(yàn)材料為室內(nèi)培養(yǎng)的高度約20cm的雜交棉及其親本幼苗，分別取其頂端葉片貯存于－80℃超低溫冰箱中備用。所用試劑中，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）、β－巰 基 乙 醇 （β－mercaptoethanol）購(gòu)自Amresco公司，十六烷基三甲基溴化胺（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（polywiny pyrro lidone40，PVP40）、三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等均購(gòu)自上海生工公司，其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

所用試劑和塑料耗材均需預(yù)先用0．1%DEPC處理24h后高溫滅菌，研缽等物品則經(jīng)180℃高溫烘烤2h以上，以避免RNase的污染。

1．2 方法

1）取1g左右的棉花新鮮幼嫩組織，加液氮充分研磨呈粉末狀，及時(shí)轉(zhuǎn)移到10mL離心管中，加5 ml的提取緩沖液（1．4mol／L NaCl，0．1mol／L Tris－HCl（pH＝8．0），20mmol／L EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%β－巰基乙醇），振蕩混勻，65℃水浴約20min，中間混合2～3次；

2）加0．6倍體積的氯仿，充分混勻，然后冰浴靜置10min；4℃，8000r／min離心20min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一新10mL離心管中，加入1／3倍體積的8mol／L的LiCl溶液，顛倒混勻，－20℃靜置2 h，4℃，8000r／min離心20min，將上清和沉淀分置2個(gè)離心管中；

3）在上清液離心管中，加入0．6倍體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，絮狀DNA用玻璃棒攪出，用70%乙醇重懸洗滌2次絮狀DNA后，加5mL dd H2O溶解，再加入0．6倍體積氯仿：異戊醇（24∶1），震蕩混勻，4℃靜置片刻，8000r／min離心15min，取上清加入0．6倍體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，于－20℃靜置1h，絮狀DNA用玻璃棒攪出，用70%乙醇重懸洗滌2次，5000r／min離心5min，吸去殘余水滴，待干后加入適量TE＋RNase A溶液（10mmol／L Tris－HCl pH 8．0，1mmol／L EDTA pH 8．0，RNase A終濃度為100μg／mL），37℃水浴中溫育溶解，取2μL檢測(cè)DNA質(zhì)量（1μL用于0．8%（W／V）瓊脂糖凝膠電泳，1μL用于分光光度計(jì)測(cè)吸光值），剩余DNA放于－70℃冰箱保存。

4）在2）棄去上清溶液的離心管中用70%乙醇洗滌沉淀2次，真空抽干后加入50μL無(wú)RNase的dd H2O充分溶解并轉(zhuǎn)入1．5mL離心管中；

5）總RNA中DNA的消化，反應(yīng)體系如下：總RNA（10～100μg），RNA 酶抑制劑（20U），不含RNA酶的DNA酶I（10U），5×DNDNase 1Buffer（10μL），用無(wú) RNase的ddH2O補(bǔ)至總體積500 μL，37℃溫育20min，加入500μL酚／氯仿（1∶1），漩渦混勻，4℃靜置片刻，12000r／min離心15min；將上清移至一干凈的微量離心管中，加入等體積氯仿，振蕩，4℃靜置片刻，12000r／min離心15min；取上清加入3mol／L pH 5．2的乙酸鈉、2倍體積的無(wú)水乙醇，－70℃放置30min～2h，12000r／min離心10min，棄上清，用500μL 70%乙醇洗滌沉淀2次，真空抽干，用35μL無(wú)RNase的ddH2O溶解沉淀，取2μL檢測(cè)RNA質(zhì)量（1μL用于1．2%（W／V）瓊脂糖凝膠電泳，1μL用于分光光度計(jì)測(cè)吸光值），剩余RNA放于－70℃冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2．1 總DNA和RNA的質(zhì)量檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明：此方法所提取的總DNA都比較完整（圖1），所提的總RNA可明顯看到28S、18S條帶，條帶整齊一致，28S亮度明顯高于18S（圖2），表明RNA降解很少，保持了RNA較好的完整性。

圖1 棉花總DNAFig．1 The total DNA from cotton

圖2 棉花總RNAFig．2 The total RNA from cotton

此方法所提總DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OD260／280值均為1．7～1．85，說(shuō)明此方法所提總DNA無(wú)糖類、酚及蛋白質(zhì)等的污染，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相符；所提總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260／280值均為1．85～1．99，表明此方法所提總RNA無(wú)DNA或蛋白質(zhì)污染；OD260／OD230值均大于2．0，表明此方法可較有效地去除多糖等雜質(zhì)。

2．2 總DNA的PCR檢測(cè)

擴(kuò)增檢測(cè)。SSR研究主要參考文獻(xiàn)［11］中的方法；AFLP研究主要參考參照文獻(xiàn)［12－14］中的方法，并稍作調(diào)整。

結(jié)果（圖3、4）表明：用該法提取的總DNA用于SSR和AFLP擴(kuò)增，均可擴(kuò)增出清晰的條帶且穩(wěn)定性好，這表明用該法提取的總DNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，可作為分子標(biāo)記應(yīng)用在棉花分子生物學(xué)研究中。

本研究直接用所提總DNA進(jìn)行SSR和AFLP

圖3 SSR檢測(cè)Fig．3SSR amplification results from DNA

圖4 AFLP檢測(cè)（HpaⅡ、MspⅠ酶切后擴(kuò)增條帶）Fig．4AFLP amplification results from DNA

2．3 總RNA的PCR檢測(cè)

RT－PCR方法是檢測(cè)RNA質(zhì)量的良好方法，多糖等雜質(zhì)的污染將抑制RNA的反轉(zhuǎn)錄［4］，擴(kuò)增基因的完整編碼區(qū)需要有良好的RNA完整性，即便微量的降解也會(huì)使mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA長(zhǎng)度大大減小，導(dǎo)致RT－PCR的失敗。因此，為了更加準(zhǔn)確地了解該法提取的總RNA是否能滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求，本研究選擇1對(duì)在棉花各組織cDNA中都可擴(kuò)增出500bp產(chǎn)物的棉花組成型表達(dá)基因 EF1α的引物（F：5′－AGACCACCAAGTACTACTGCAC－3′，5′－CCACCAATCTTGTACACATCC－3′）對(duì)所提RNA 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，瓊脂糖電泳檢測(cè)在預(yù)期500bp處出現(xiàn)亮的條帶（圖5），同時(shí)參照文獻(xiàn)［15－17］中的方法對(duì)所提RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行cDNA－AFLP擴(kuò)增檢測(cè)（圖6），也得到了清晰穩(wěn)定的條帶，證實(shí)本研究制備的RNA的完整性好，并且純度較高，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作的要求。

圖5 RT－PCR檢測(cè)Fig．5RT－PCR amplification results from RNA Fig

圖6 cDNA－AFLP檢測(cè)（2對(duì)引物擴(kuò)增條帶）Fig．6cDNA－AFLP amplification results from RNA

3 討論

棉花富含多糖、酚類、單寧等次生物質(zhì)，如多糖、脂類的存在會(huì)使DNA、RNA的溶解度降低，同時(shí)還可以抑制許多工具酶的活性，多酚、色素等物質(zhì)在提取過(guò)程中很容易被氧化導(dǎo)致DNA、RNA變褐活性喪失，影響DNA、RNA用于進(jìn)一步的分子操作，因此能否在提取過(guò)程中盡量去除這些干擾物質(zhì)是獲得高質(zhì)量棉花總DNA、RNA的關(guān)鍵。高質(zhì)量的棉花組織總DNA和RNA的成功提取又是順利進(jìn)行文庫(kù)和遺傳圖譜構(gòu)建，基因克隆、表達(dá)和調(diào)控及遺傳轉(zhuǎn)化分析等棉花分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。

CTAB是一種去污劑，它能夠溶解細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞破裂，并與細(xì)胞內(nèi)的核酸形成核酸－CTAB復(fù)合物［18］，這種復(fù)合物在沉淀的時(shí)候把蛋白、多糖、色素以及多酚類化合物與核酸徹底的分離開來(lái)，此外與提取緩沖液中的EDTA一起，共同保護(hù)DNA免受內(nèi)源核酸酶的降解。提取液中的β－巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加，其作為強(qiáng)還原劑能防止多酚被氧化，同時(shí)提取液中含有的聚乙烯吡咯烷酮（PVP－40），可與酚類化合物形成鰲合物，阻止其成為多酚氧化酶的底物而被氧化，使之不能與核酸結(jié)合，保證核酸的質(zhì)量；提取液中高濃度的NaCl有利于降低多糖的含量［4］；核酸（DNA、RNA）在細(xì)胞內(nèi)部主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物的形式存在，因此分離DNA、RNA時(shí)必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)。除去蛋白質(zhì)主要用氯仿－異成醇混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，然后通過(guò)離心分層，DNA和RNA溶于上層水相，而變性蛋白質(zhì)停留在水相及氯仿相中間而被除去；本研究在上述研究基礎(chǔ)上利用DNA和RNA在LiCl溶液中溶解度的差異將溶于上層水相的二者分離開來(lái)。在水相中加入LiCl溶液在－20℃放置一段時(shí)間后，RNA會(huì)特異性的沉淀下來(lái)，而DNA會(huì)繼續(xù)留在水相中，通過(guò)離心可使RNA分離出來(lái)。而留在上清液中的DNA會(huì)和預(yù)冷的異丙醇較快生成絮狀物被分離出來(lái)。提取步驟中使用的乙酸鈉和低濃度的乙醇，不僅可以幫助去除多糖，還可以去除色素類物質(zhì)［19］。

在提取過(guò)程中為避免所提取的DNA中含有的少量RNA對(duì)下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的影響，可在加入TE溶液溶解DNA時(shí)同時(shí)加入RNase A（終濃度為100μg／mL）以除去RNA；同樣為避免所提取的RNA中含有的少量DNA對(duì)下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的影響，可加入不含RNA酶的DNase I除去DNA；為減少外源RNase對(duì)RNA的降解，試劑和塑料耗材需預(yù)先用0．1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡處理24h后高溫滅菌，為避免內(nèi)源RNase對(duì)RNA的降解，可以加入適量的RNase抑制劑。同時(shí)整個(gè)提取過(guò)程中還應(yīng)注意避免過(guò)酸過(guò)堿或高溫環(huán)境，合適的溫度為0～4℃，pH 4～9，避免劇烈振蕩和防止機(jī)械力對(duì)DNA的切割作用；整個(gè)操作步驟應(yīng)盡量簡(jiǎn)化，縮短實(shí)驗(yàn)過(guò)程，減少核酸變性、降解、機(jī)械切割的機(jī)會(huì)。

與現(xiàn)有的棉花總DNA和RNA提取法相比，本方法所需用樣品數(shù)量、試劑、操作步驟、操作時(shí)間明顯減少，整個(gè)DNA和RNA提取工作可在1d內(nèi)完成。同步提取的棉花DNA和RNA，能滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)如 SSR、AFLP、RT－PCR、cDNAAFLP的要求，有效地節(jié)約了樣品數(shù)量和操作時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

4 結(jié)論

本研究在借鑒各種植物DNA和RNA提取方法的基礎(chǔ)上，摸索出一套適合于棉花組織DNA和RNA同步提取的方法。該方法所用的都是常規(guī)試劑，不但操作簡(jiǎn)單，易于重復(fù)，同時(shí)還可節(jié)約樣品數(shù)量、試劑成本及提取時(shí)間，同步提取出的高質(zhì)量棉花

DNA和RNA，能滿足許多后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求，對(duì)于樣品稀少珍貴的材料和樣本數(shù)量較多的研究尤為適用。此研究不僅為其它下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也可為其它多酚、多糖作物同步提取其DNA和RNA提供參考。

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