張 飛，聶麥茜

廢棄食用油脂(Waste edible oils，WEOs)是指餐飲業(yè)、食品加工業(yè)在生產(chǎn)經(jīng)營活動中產(chǎn)生的不能再食用的動植物油脂，包括油脂使用后產(chǎn)生的不可再食用的油脂(如炸制老油、火鍋油等)，含油脂廢水經(jīng)油水分離器或者隔油設(shè)施分離出的不可再食用的油脂［1］。近年來，廢棄食用油脂流入食品市場所造成的危害已經(jīng)引起人們的高度重視。單細(xì)胞蛋白(Single cell protein，SCP)，亦稱微生物蛋白或菌體蛋白，主要是指利用酵母、細(xì)菌、真菌和某些低等藻類等微生物，在適宜基質(zhì)和條件下進(jìn)行培養(yǎng)獲得微生物菌體，然后從菌體中提取的蛋白質(zhì)［2］。單細(xì)胞蛋白的開發(fā)與生產(chǎn)為解決動物飼料和人類食品問題開辟了新途徑。因此，將廢棄食用油脂生物轉(zhuǎn)化成富含營養(yǎng)的單細(xì)胞蛋白，既可減輕環(huán)境壓力，又能產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1原料

廢棄食用油脂由校學(xué)生食堂提供。試驗(yàn)前做預(yù)處理:將廢棄煎炸油冷卻至室溫，沉淀48 h后，過濾以除去上層泡沫和下層固體雜質(zhì)［3］。處理后的樣品作為微生物利用的碳源。經(jīng)測定，油密度為0.873 g/mL.

1.2 菌種來源與篩選

前期從陜北石油污染土壤中經(jīng)富集、分離、純化得到的石油烴降解菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。以廢棄食用油脂為碳源，分別將菌株搖瓶培養(yǎng)，取3個平行樣，測其培養(yǎng)前后發(fā)酵液的光密度(OD)差值，選取OD差值最大的菌種做后續(xù)研究。

1.3 SCP生產(chǎn)試驗(yàn)

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

斜面培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基［4］。種子培養(yǎng)基:成分同斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基［5］成分如下:磷酸鹽緩沖液:K2HPO4·3H2O 81.22 g，NaH2PO4· 2H2O 42.9 g，用NaOH調(diào)pH為7.5，蒸餾水定容至1 000 mL;1 mol/L MgSO4溶液;1 mol/L CaCl2溶液;取上述磷酸鹽緩沖液25.0 mL，MgSO4溶液0.5 mL，CaCl2溶液 0.1 mL，微量元素溶液1.0 mL，1.0 g NH4NO3，定溶至1 000 mL。于121℃蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3.2 培養(yǎng)過程

(1)種子擴(kuò)大培養(yǎng):挑取冷藏的斜面菌種，接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶內(nèi)，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，制成菌懸液備用。

(2)發(fā)酵培養(yǎng):移取一定量種子菌懸液，接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，紗布封口，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。每個條件采用3個平行樣同時培養(yǎng)，測定值取平均值。

(3)菌體的收獲:將發(fā)酵培養(yǎng)液于8 000 r/min下離心10 min，收集菌體用蒸餾水洗3次，105℃烘箱中烘干。

1.4 分析項目及方法

1.4.1 細(xì)胞產(chǎn)量的測定

以每升培養(yǎng)液細(xì)胞干質(zhì)量表示［6］。取發(fā)酵培養(yǎng)液40 mL，于8 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用蒸餾水洗滌3次，再離心，最后一次菌體用少量蒸餾水洗至已稱重的坩堝內(nèi)，105℃ 烘箱中烘至恒重，稱量。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用常量凱氏定氮法［7］:稱取菌體產(chǎn)品0.1 g置于500 mL凱氏燒瓶中，加入0.2 g硫酸銅(CuSO4·5H2O)，6 g硫酸鉀，10 mL濃硫酸和數(shù)粒玻璃珠。置通風(fēng)柜內(nèi)加熱煮沸至產(chǎn)生三氧化硫白煙，待溶液變澄清且呈綠色后繼續(xù)消解15 min，放冷，將消解液全部轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。量取100 mL消解液至凱氏瓶中，加入20 mL 40%氫氧化鈉，迅速連接氮球和冷凝管，用50 mL 2%硼酸溶液(加2滴甲基紅-亞甲基藍(lán)混合指示劑)吸收，搖動凱氏燒瓶使溶液充分混合，加熱蒸餾至冷凝管流出液為中性為止。餾出液用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1/2H2SO4= 0.01 mol/L)滴定至綠色轉(zhuǎn)變至淡紫色為止。

粗蛋白含量用下式計算:

式中:

V2——滴定樣品時消耗硫酸溶液體積，mL;

V1——空白試驗(yàn)消耗硫酸溶液體積，mL;

C——經(jīng)標(biāo)定的硫酸溶液濃度，mol/L;

W——樣品質(zhì)量，g。

1.4.3 測試方法

1.5 發(fā)酵條件研究

1.5.1 單因素試驗(yàn)

分別考察了5種因素(培養(yǎng)基初始pH值、碳源投加量、氮源種類、發(fā)酵時間、碳氮比)對單細(xì)胞蛋白產(chǎn)量的影響，對每個因素進(jìn)行了單因子試驗(yàn)。

1.5.2 正交試驗(yàn)

為了尋找試驗(yàn)菌種的最佳發(fā)酵條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對pH值、碳源投加量、氮源及發(fā)酵時間進(jìn)行了正交試驗(yàn)。每個因素設(shè)計了3個水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

為篩選出能夠較好利用廢棄食用油脂的菌種，將本實(shí)驗(yàn)室保存的10株細(xì)菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:氮源NH4NO3濃度1 g/L，碳源投加量4%，培養(yǎng)基pH值7.5，30℃搖床培養(yǎng)48 h。測定培養(yǎng)液的OD差值，結(jié)果如表1所示。

表1 細(xì)菌對廢棄食用油脂的利用情況

從表1看，S5菌株細(xì)胞增殖最多，這說明S5菌株能夠較好地利用廢棄食用油脂生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。且從同課題組得知，S5菌株在生長過程中可產(chǎn)生鼠李糖脂生物表面活性劑，這種表面活性劑能使油脂較好地分散于培養(yǎng)體系中，促進(jìn)細(xì)菌對碳源的利用。因此，選取S5菌株作為發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最適菌種。

不少家庭服務(wù)企業(yè)表示，河北省家政服務(wù)人員的輸出，多采用“單兵作戰(zhàn)”模式，河北與京津家庭服務(wù)企業(yè)間的合作較少，致使河北省家政服務(wù)人員的輸出呈現(xiàn)“小、散、亂”的現(xiàn)象，就業(yè)不穩(wěn)定，市場難規(guī)范。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源投加量對發(fā)酵過程中細(xì)胞產(chǎn)量的影響

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分，碳源投加量對細(xì)胞產(chǎn)量有一定影響。試驗(yàn)比較了體積分?jǐn)?shù)為2%～10%的5種不同投加量的廢棄煎炸油對細(xì)胞產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源投加量對細(xì)胞產(chǎn)量的影響

從圖1可以看出，4%(約35 g/L)的碳源投加量可得到最高的細(xì)胞產(chǎn)量，這與之前Zhu等人的研究結(jié)果相近［3］。油的投加量過小，供微生物生長的碳源不足，投加量過大，過多的油脂造成培養(yǎng)液中的溶解氧含量降低，S5為好氧細(xì)菌，過低的溶解氧會抑制其生長。

2.2.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵過程中細(xì)胞產(chǎn)量的影響

圖2為S5菌株在培養(yǎng)過程中生物量隨發(fā)酵時間的變化情況。由圖2可知，菌體濃度在30 h至72 h趨于穩(wěn)定，此時微生物生長處于靜止期，72 h后進(jìn)入衰亡期。為節(jié)省能源，可取48 h為最佳發(fā)酵時間。pH總體呈下降趨勢，說明該發(fā)酵過程是一個產(chǎn)酸過程。

圖2 發(fā)酵時間對細(xì)胞產(chǎn)量的影響

2.2.3 不同氮源對發(fā)酵過程中細(xì)胞產(chǎn)量的影響

氮源提供微生物合成蛋白質(zhì)所需的原料。本試驗(yàn)對比了5種無機(jī)氮源對細(xì)胞產(chǎn)量的影響(圖3)，結(jié)果顯示，氮源為硝酸鉀時的細(xì)胞產(chǎn)量最大，且相比于銨態(tài)氮，硝態(tài)氮更有利于細(xì)菌生長。

圖3 不同氮源對細(xì)胞產(chǎn)量的影響

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵過程中細(xì)胞產(chǎn)量的影響

大多數(shù)細(xì)菌的pH適應(yīng)范圍在4～10之間，一般要求中性和偏堿性。從圖4看，細(xì)菌S5在利用廢棄食用油脂發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白時，在pH 6～10范圍內(nèi)均可生長，在pH 9時可獲得最高的細(xì)胞產(chǎn)量?？梢?，S5的pH適應(yīng)范圍較大，在偏堿性和堿性條件下生長較好。

圖4 初始pH對細(xì)胞產(chǎn)量的影響

2.2.5 碳氮比對發(fā)酵過程中細(xì)胞產(chǎn)量的影響

不同微生物細(xì)胞的元素組成比例不同，對各營養(yǎng)元素的比例要求也不同，這里主要指碳氮比(或碳氮磷比)。從圖5看，細(xì)菌S5在C/N(廢棄食用油與KNO3的質(zhì)量比)為3∶1時細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)到最大(此時硝酸鉀濃度為11.6 g/L)，可產(chǎn)生5.5 g/L的干細(xì)胞物質(zhì)。因此，S5菌在以硝酸鉀為氮源時，最佳C/N為3∶1。

圖5 C/N對細(xì)胞產(chǎn)量的影響

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)的設(shè)計見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果及其統(tǒng)計學(xué)分析如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)水平與因素

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3可以看出，4個因素對S5菌株發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白影響的主次順序?yàn)?氮源種類＞碳源投加量＞發(fā)酵時間＞pH值。從中確定最優(yōu)化組合為A3B3C2D1，即最優(yōu)培養(yǎng)條件為:初始pH值9，氮源為硝酸鉀，碳源投加量4%，發(fā)酵時間48 h。

2.4 蛋白質(zhì)含量

單細(xì)胞蛋白可以被用來補(bǔ)充食物中的蛋白質(zhì)，從而替代價格較高的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)來源，如豆粉、魚粉等，緩解蛋白質(zhì)缺乏問題。有關(guān)文獻(xiàn)表明，利用酵母菌生產(chǎn)的SCP的蛋白質(zhì)含量為30%～60%，而利用細(xì)菌所產(chǎn)蛋白含量較高，可為50%～80%，氨基酸含量也較高［9-10］。

將不同氮源條件下培養(yǎng)得到的S5菌體烘干，采用凱氏定氮法測定粗蛋白含量，所得結(jié)果如表4所示。

表4 S5在不同氮源條件下的粗蛋白含量

結(jié)果表明，S5菌以氯化銨和硫酸銨為氮源生產(chǎn)的SCP粗蛋白含量最高，分別為59.6%和59.5%。結(jié)合2.2.3結(jié)果，經(jīng)計算得到這5種氮源生產(chǎn)的SCP的粗蛋白產(chǎn)量(表4)，S5菌以硝酸鉀為氮源時的蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高，雖然用氯化銨作氮源可以得到蛋白含量較高的SCP，但其細(xì)胞產(chǎn)量低，蛋白質(zhì)產(chǎn)量也較低。

3 結(jié)論

S5菌株可作為利用廢棄食用油脂發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最適菌種，最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH 9，碳源投加量4%(體積比)，氮源為硝酸鉀，C/N為3∶1，發(fā)酵時間48 h。細(xì)胞產(chǎn)量可達(dá)5.5 g/L，收獲SCP產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量為43.8%～59.6%。

［1］黃翔峰，陳旭遠(yuǎn)，劉佳，等.廢棄食用油脂生物合成鼠李糖脂研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報，2009，36(11): 1738-1743.

［2］齊銀霞，成堅，劉長海.利用廢棄資源發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(5):366-368.

［3］Zhu Y，Gan J J，Zhang G L，et al.Reuse of waste frying oil for production of rhamnolipids using Pseudomonas aeruginosa zju.u1M［J］.Journal of Zhejiang University-Science A，2007，8(9):1514-1520.

［4］周群英，高廷耀.環(huán)境工程微生物學(xué)［M］.2版.北京:高等教育出版社，2000:124-126.

［5］王蕾，聶麥茜，王志盈.多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其對芘的降解研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù).2010，33(1):43 -47.

［6］李建政，張平，鮑立新，等.大豆乳清廢水發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的酵母［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，41 (2):48-52.

［7］馬丹.凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量［J］.計量與測試技術(shù)，2008，35(6):57-58.

［8］付源，李建政，鮑立新，等.大豆蛋白廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的菌種選擇及其培養(yǎng)條件［J］.科技導(dǎo)報，2007，25 (11):9-13.

［9］梁耀相.利用工業(yè)廢水、廢渣開發(fā)飼用SCP的研究［J］.寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2001(2):100-102.

［10］Anupama P Ravindra.Value-added food:Single cell protein［J］.Biotechnology Advances，2000，18:459–479.