渠云芳，黃晉玲，賀潤平

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山西太原030032）

棉花有51 個種[1]，除了4 個栽培種之外，其余的為野生種。野生種具有很多栽培種不具有的優(yōu)良特性，尤其是在抗逆性、抗病蟲、種子無腺體植株有腺體等方面[2]。為了將野生種的優(yōu)良特性轉(zhuǎn)移到栽培種上，提高栽培種尤其是栽培陸地棉的應(yīng)用價值，國內(nèi)外育種專家早已廣泛開展了棉屬遠(yuǎn)緣雜交野生棉特性的轉(zhuǎn)育工作，已經(jīng)獲得了20 余種野生資源與陸地棉的高代雜種，并從中選育了大批性狀基本穩(wěn)定的陸地棉型優(yōu)異種質(zhì)系[3-6]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種組為了將比克氏棉的子葉腺體延緩形成特性轉(zhuǎn)移到陸地棉上，采用先把亞洲棉（G arboreum）和比克氏棉（G bickii）雜交，然后再進(jìn)行染色體加倍，將合成的異源四倍體再與陸地棉（G hirsutum）雜交，獲得了三種雜種。本研究從細(xì)胞學(xué)以及RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)方面，對亞比棉與陸地棉合成的三種雜種進(jìn)行了遺傳分析，并檢測了三種雜種中野生棉與栽培棉的遺傳成分，為以后的研究奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料：1.亞洲棉（A2）；2.比克氏棉（G1）；3.亞洲棉×比克氏棉異源二倍體（A2G1）；4. 亞洲棉×比克氏棉雙二倍體（A2A2G1G1）；5. 陸地棉（[AADD]1）；6.（A2×G1）×（[AADD]1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)方法 種子預(yù)先浸種1 d，于25～30 ℃條件下發(fā)芽，待根尖長至2～3 cm 長時，截取2～3 mm的根尖，用飽和對二氯苯溶液預(yù)處理2.0～2.5 h，卡諾固定液（無水乙醇∶冰乙酸＝3∶1）固定2～24 h，2%纖維素酶和果膠酶混合水溶液在28～35 ℃下酶解30～60 min，經(jīng)預(yù)熱60 ℃的0.5 mol/LHCl 解離8～15 min，卡寶品紅染色壓片。

核型分析方法參照聶如芝[7]的報道，將所得染色體圖像進(jìn)行編號，并測量其長臂、短臂值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行同源染色體的人工配對，并按染色體的長度從長至短順序編號，最后取5～12 個細(xì)胞染色體參數(shù)平均值作為該棉種的染色體數(shù)。

1.2.2 RAPD 分子標(biāo)記方法

1.2.2.1 總DNA 的提取 參照CTAB 法[8]進(jìn)行。

1.2.2.2 引物及其來源 使用的15 個隨機(jī)引物（長度為10 個核苷酸序列），均購于上海生物技術(shù)公司。

1.2.2.3 RAPD 反應(yīng) 在PTC-100 熱循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)體積為25 μL，其中含1×buffer，1.5 mmol/LMgCl2，0.2 mmol/LdNTP，0.4 μmol/L引物，50 ng DNA，1.0 U Taq 酶，雙蒸水補(bǔ)足25 μL，上覆30 μL礦物油。

PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，共10個循環(huán)；89 ℃變性20 s，36 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，膠中加入0.5 g/LEB。電泳結(jié)束后，紫外檢測，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描照相。

每次試驗均重復(fù)2 次，只有2 次重復(fù)均相同的擴(kuò)增帶才被用作特征帶分析。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 RAPD 擴(kuò)增產(chǎn)物以0，1統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)矩陣，在相同遷移位置上有帶的記為1，無帶的記為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞比棉×陸地棉雜種F1 的核型分析

從圖1 可以看出，三種雜種亞比棉×陸地棉的染色體數(shù)目為2n=4x=52。參照Levan[9]的方法按著絲點(diǎn)位置劃分染色體類型，其核型公式為：2n=4x=52=2M+44m（2SAT）+6sm（2SAT）。

表1為三種雜種亞比棉×陸地棉的染色體參數(shù)。從表1 可以看出，其染色體相對長度的變異范圍在6.12%～2.56%之間。臂比值變化于1.00～1.82 之間，最長染色體與最短染色體之比為2.39∶1，平均臂比為1.35，臂比大于2∶1 的染色體百分率為0。根據(jù)Stebbins[10]的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，核型類型為1B。其中，第7，8，9，10 對為亞中著絲粒（sm）染色體，第18 對為正中著絲粒（M）染色體，余者均為中著絲粒（m）染色體。在第10，13 對染色體短臂上各帶有1 對隨體。

表1 亞比棉×陸地棉雜種F1 的染色體參數(shù)

2.2 RAPD 分析

2.2.1 引物篩選與RAPD 標(biāo)記的多態(tài)性 根據(jù)有關(guān)棉花的相關(guān)文獻(xiàn)，從初選的引物中篩選出15 個能擴(kuò)增出多態(tài)性帶的引物。從表2 可以看出，15 個引物均有擴(kuò)增產(chǎn)物，總共擴(kuò)增出115 條DNA 帶，其中多態(tài)性帶為95 條，多態(tài)性比例占82.6%。引物不同擴(kuò)增的片段數(shù)也不同，平均每個引物可擴(kuò)增出7.7 條DNA 帶。從表2 還可以看出，不同引物擴(kuò)增出的DNA 帶差異極大，最多的可擴(kuò)出15 條帶（S37），最少的僅有3 條帶（S1485和S1288），而且多態(tài)性也不同，多態(tài)性帶所占比例變化幅度也大。多態(tài)性位點(diǎn)百分率最高的為100%，最低的為33.3%。這是因為三種雜種分別屬于3 個不同的染色體組的野生種與栽培種，其親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，所以參試材料表現(xiàn)出豐富的多樣性。

表2 不同隨機(jī)引物擴(kuò)增6個材料的多態(tài)性

2.2.2 亞比棉×陸地棉雜種F1及其親本的多態(tài)性差異比較 亞洲棉、比克氏棉、陸地棉、亞比棉與亞比棉×陸地棉F1雜種的多態(tài)性差異比較如圖2 所示。

從15 個引物對三種雜種及其各個親本的擴(kuò)增結(jié)果看，亞比棉×陸地棉雜種F1共擴(kuò)增出61條DNA 帶，其中具亞洲棉特異帶的為2 條，占總帶數(shù)的3.3%；來自比克氏棉的帶為6 條，占9.8%；具陸地棉特異帶的為8 條，占13.1%；來自亞比棉的特異帶為6 條，占9.8%。在雜種后代中還有一些其他帶型，如與亞洲棉和比克氏棉相同的帶6 條，與比克氏棉和陸地棉相同的帶7 條，與亞洲棉和陸地棉相同的帶3 條。雜種的特異帶為9 條，占14.8%。材料中還檢測到雙親的共有帶，表明后代中存在著豐富的遺傳變異。以上結(jié)果也表明，利用RAPD 技術(shù)可以檢測遠(yuǎn)緣雜種材料中親本的遺傳成分。

3 討論

3.1 染色體的探討

三種雜種亞比棉×陸地棉的染色體數(shù)目為52 條，與親本陸地棉、亞比棉的染色體數(shù)目相同，但染色體類型變化很大，有44 條中著絲粒染色體（m），6 條亞中著絲粒染色體（sm），還有2 條正中部著絲粒染色體（M）。這與親本的染色體形成了極大區(qū)別。亞比棉雙二倍體有50 條中部著絲粒染色體（m），亞中著絲粒染色體（sm）有2條。陸地棉有32 條中部著絲粒染色體（m），有18條亞中著絲粒染色體（sm），有2 條近端著絲粒染色體（st）。根據(jù)所得的染色體參數(shù)，可初步判定雜種的第2 對染色體可能來自亞洲棉的第13對，雜種的第6，11，19 對染色體可能來自亞比棉的第2，5，18 對，亞比棉×陸地棉的第4，7，8，17，21，24 對染色體可能來自陸地棉的第3，6，9，14，18，25 對。

3.2 利用RAPD 可以檢測遠(yuǎn)緣雜種后代各個親本的遺傳組成

劉根齊等[11-12]和聶以春等[13-14]分別利用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)，對少數(shù)種間雜交系進(jìn)行了分析，結(jié)果均表明，種間雜交種質(zhì)系中均發(fā)現(xiàn)野生親本的特征帶，認(rèn)為利用RAPD 標(biāo)記技術(shù)可以檢測到種間雜交系中的野生親本遺傳成分。李景環(huán)等[15]用RAPD 標(biāo)記對加拿大披堿草和老芒麥及其雜種F1，F(xiàn)2進(jìn)行了研究，研究結(jié)果充分驗證了雜種的真實(shí)性。云興福等[16]利用RAPD 標(biāo)記對黃瓜自交系及其F1代進(jìn)行了研究，揭示了黃瓜親本自交系及其與F1的遺傳差異，研究結(jié)果表明，RAPD 標(biāo)記用于黃瓜遺傳差異的研究切實(shí)可行。本研究利用RAPD 技術(shù)，在雜種F1中既檢測出了與亞比棉相同的帶，又檢測出了與陸地棉相同的帶，還分別檢測出了與比克氏棉、亞洲棉相同的帶，并且還檢測出了雜種的特異帶，這說明利用RAPD 分子標(biāo)記可以檢測種間雜交系中的野生棉遺傳成分，可以促進(jìn)種間雜交在常規(guī)育種、理論研究等領(lǐng)域的有效利用。

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