陳書明，常云花，梁新峰，曹新鵬，范 瑾

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）簡(jiǎn)稱白介素，是由白細(xì)胞產(chǎn)生并介導(dǎo)于細(xì)胞間相互作用的一類細(xì)胞因子。其主要作用是通過T和B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞等多種靶細(xì)胞來傳遞免疫信息，以激活、調(diào)控血細(xì)胞的生長發(fā)育與分化成熟，并參與機(jī)體的免疫應(yīng)答以及某些疾病的病理過程[1-3]。目前，IL已作為藥物應(yīng)用于臨床，但用傳統(tǒng)的從組織中分離純化IL，很難實(shí)現(xiàn)IL的大量生產(chǎn)。因此，通過RT-PCR技術(shù)獲得IL的目的基因，再用基因工程技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)IL成為科研工作者努力的方向。而獲得IL的目的基因需要先從脾臟組織提取出純度高、完整性好的總RNA。目前，已有多種方法與產(chǎn)品應(yīng)用于總RNA提取和純化，但在實(shí)驗(yàn)過程中，總RNA極易被實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在的RNA酶降解，或提取出來的總RNA中常伴有大分子量染色體DNA的污染[4-7]。

本研究通過控制RNAiso Plus試劑和脾臟組織用量比例，對(duì)組織和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行特殊處理，反復(fù)研究，最終從麻雞脾臟組織中提取出純度高、完整性好的總RNA。該研究對(duì)分子克隆獲得相關(guān)目的基因等后續(xù)實(shí)驗(yàn)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 自山西省太谷縣某雞場(chǎng)購進(jìn)80日齡健康麻雞1只。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 Agarose（瓊脂糖）為Amresco原裝進(jìn)口；RNAiso Plus購自大連寶生物工程有限公司；Tris和DEPC均購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；EDTA、硼酸、95%乙醇、異丙醇、氯仿、溴化乙錠均為國產(chǎn)分析純。75%乙醇、溴化乙錠等用RNase-free ddH2O配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 在潔凈環(huán)境下將麻雞殺死，迅速取出其脾臟，用刀片切成約140，120，80mg的小塊組織，用滅菌紗布包裹后懸吊于液氮罐中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA時(shí)，從液氮罐中取約140，120，80mg小塊組織各1塊，迅速轉(zhuǎn)移至3個(gè)液氮預(yù)冷的研缽中研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，否則會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量）；再向3個(gè)研缽中各加1mL RNAiso Plus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫下靜置，待其溶化；然后將各組勻漿液轉(zhuǎn)移至已標(biāo)記的EP管中，室溫靜置5min。

1.2.2 制備RNA沉淀 將EP管中的勻漿液在4℃，12 000 r/min條件下離心5min；小心吸取上清液，分別移入已滅菌標(biāo)記的EP管中（切勿吸取沉淀）；再向EP管中分別加入0.2mL氯仿，蓋緊管蓋，用旋渦振蕩儀混勻至溶液呈乳白狀（無分層現(xiàn)象），室溫靜置 5min；4℃，12 000 r/min離心15min。此時(shí)，EP管中液體分為3層，即含有RNA的無色上清液，中間的白色蛋白層和帶有紅色的下層有機(jī)相。小心吸取上清液并分別轉(zhuǎn)移至新標(biāo)記的3個(gè)已滅菌的EP管中（切勿吸取白色中間層），再分別加入等體積的異丙醇，上下顛倒EP管充分混勻，室溫下靜置10min；然后于4℃，12 000 r/min離心10min，可見EP管底部出現(xiàn)乳膠狀沉淀，小心棄去上清液，保留沉淀，即為RNA沉淀。

1.2.3 RNA沉淀的洗滌 沿保留RNA沉淀的EP管的管壁緩緩加入75%的乙醇1mL，輕輕上下顛倒EP管5次，在4℃下，12 000 r/min離心5min；然后小心棄凈EP管中的乙醇溶液，再將EP管插入超凈工作臺(tái)面的樣品孔中，通風(fēng)干燥5min，使乙醇揮發(fā)干凈（不可以加熱干燥，否則RNA將很難溶解），再用RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，從而獲得RNA溶液。

1.2.4 RNA純度與完整性的檢測(cè) 取3μL RNA溶液與等量的上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)所提取RNA的純度與完整性。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定剩余RNA溶液的A260與A280，并計(jì)算二者的比值A(chǔ)260/A280，進(jìn)一步分析所提取RNA的純度。

2 結(jié)果與分析

對(duì)脾臟組織用量約為80 mg時(shí)提取的總RNA進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)得出，A260=0.896，A280=0.452，A260/A280=1.982。

從圖1可以看出，當(dāng)組織用量約140mg時(shí)，RNA幾乎全部降解（圖1-A）；當(dāng)組織用量約120mg時(shí)，RNA降解嚴(yán)重（圖1-B）；當(dāng)組織用量控制在約80mg左右時(shí)，提取到的RNA電泳圖譜中可見清晰的3條帶（圖1-C），分別為5S，18S，28 S，A260/A280=1.982，1.8＜A260/A280＜2.0，說明從雞脾臟組織中提取的RNA純度與完整性良好。表明用1mL的RNAiso Plus試劑，并且把脾臟組織用量控制在80mg左右時(shí)，可提取出純度高、完整性好的總RNA。

3 討論

本研究表明，用相同量的提取劑（RNAiso Plus）提取麻雞脾臟組織中的RNA時(shí)，并不是組織越多，提取的RNA量就越多；相反，過量的組織中存在過量的RNA酶，所加的RNAiso Plus試劑不能抑制過量RNA酶的活性，使得提取過程中RNA很快被降解。但是，試驗(yàn)所用脾臟組織也不可太少，否則會(huì)因樣品中總RNA含量不足，難以提取出足夠量的純度高、完整性好的總RNA。

本實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵是有無RNA酶的污染。RNA極不穩(wěn)定，易被RNA酶降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩(wěn)定，故在提取RNA時(shí)需最大程度地避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，除了用液氮迅速處理新鮮的麻雞脾臟組織、控制RNAiso Plus試劑和脾臟組織用量比例，以抑制內(nèi)源RNA酶的活力外，還用DEPC溶液對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用物品進(jìn)行了處理，使用RNA專用儀器設(shè)備，操作過程中使用一次性PE手套和口罩等。上述措施對(duì)本實(shí)驗(yàn)的成功起了非常重要的作用。

［1］ 陳紅英，崔保安，黃青云，等.海藍(lán)雞白細(xì)胞介素18全基因的克隆與序列分析 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（1）：48-50.

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［3］ 徐永莉，王紅寧，黃勇，等.雞白介素的分子生物學(xué)和應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（6）：57-60.

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