何擴，張秀媛，袁永俊

（1.河北北方學院食品科學系，河北 張家口 075131；2.西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

超濾法純化酪蛋白凝乳酶水解物中的酪蛋白糖巨肽

何擴1，張秀媛1，袁永俊2

（1.河北北方學院食品科學系，河北 張家口 075131；2.西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

研究超濾法分離純化了（CGMP）的條件，得到超濾的最佳條件是在室溫下，壓差為0.02 MPa，濃縮比為8。通過此方法得到比較純的CGMP，蛋白回收率為1.77%，糖基化程度（唾液酸/蛋白質）為70.1 μg/mg，并且此方法適用于工業(yè)化生產。

酪蛋白糖巨肽；超濾；唾液酸

酪蛋白糖巨肽（CGMP）是蛋白酶酶解κ-酪蛋白得到的C末端親水性糖肽，其獨特的氨基酸組成和含有豐富的唾液酸使其具有多種生理功能，如能抑制胃分泌物；能調節(jié)免疫系統(tǒng)反應；能抑制病原體包括病毒和細菌等黏附至細胞；能結合霍亂和埃希氏大腸桿菌的腸毒素等。除此之外，CGMP還是苯丙酮尿患者膳食中的首選成分，并且在控制肝病方面也有成效[1-2]。有人對沉淀法和離子交換樹脂分離純化胃蛋白酶水解酪蛋白的水解物制備CGMP的條件進行了研究[3-4]。本文對超濾法分離純化凝乳酶水解酪蛋白的水解物制備CGMP的條件進行了研究，此方法適用于工業(yè)化生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪素（BR）、間苯二酚（AR）、考馬斯亮藍G-250（BR）、醋酸銨（AR）：成都市科龍化工試劑廠；凝乳酶（1:100000）：上海阿敏生物技術有限公司；唾液酸標準品（HPLC）；牛血清白蛋白（BR）：上海伯奧生物技術有限公司；其它試劑均為國產分析純。

PES-200超濾膜（切割分子量20000 u，有效過濾面積0.6 m2）、SMB-20型超濾裝置：中科院上海原子核研究所；ZT60-600a型蠕動泵：保定蘭格恒流泵有限公司；Superdex 7510/300 GL、AKTA purifier：Amersham Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 酪蛋白水解液的制備及其初步分離[5]

酪蛋白濃度為10 mg/mL，凝乳酶/底物為0.6/100，溫度為40℃，pH為6.6條件下，水解2.5 h后，調pH為8～8.5，在75℃水浴保溫30 min終止反應，冷卻后調pH為4.6，真空抽濾除去沉淀，并用一定量水洗滌沉淀，合并上清液和洗滌液調pH為7.0，即得到酪蛋白水解液，微濾后備用。

1.2.2 超濾工藝流程

1.2.3 超濾分離指標[6]

1.2.3.1 滲透通量J

單位時間內通過單位膜面積的滲透液的體積，單位通常用L/（m2·h）。本試驗只用到了一種PES-200超濾膜，有效濾膜面積恒定，為了方便，用單位時間內通過膜的滲透液體積表示通量，單位為mL/min。

1.2.3.2 滲透通量衰減率

達到濃縮效果時滲透通量與初始滲透通量之差與初始滲透通量之比。

1.2.3.3 濃縮比

最初進料液體積與超濾過程中任意時間的濃縮液體積的比率。

1.2.4 超濾條件的選擇

在室溫下，研究超濾壓差對滲透通量的影響、滲透通量衰減曲線和濃縮比對超濾性能的影響。

1.2.5 唾液酸含量的測定

采用間苯二酚-鹽酸法[5]。

1.2.6 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍比色法[7]。

2 結果與分析

2.1 超濾壓差對滲透通量的影響

本試驗中壓差由泵的蠕動提供，考慮到泵的極限轉速，測定了 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 MPa 不同壓差下濾液通量的變化，見圖2。

由圖2可知，壓差較小時，料液透過平均通量隨壓差的增加而增加較快，當壓差達到0.02 MPa時，料液透過平均通量隨壓差增加變得增加緩慢，這符合超濾過程中濃差極化和凝膠層理論[8]。在低壓范圍內，壓差的增加使小分子物質以很快的速度透過膜，而隨著壓差增大過程中，污染層被壓實，濃差極化加劇，使膜污染加快，使透過速度增加緩慢。綜合考慮選擇0.02MPa作為超濾過程的壓差。

2.2 滲透通量衰減曲線

研究了單級間歇操作中，在一定壓力差下，2000mL酶解液隨著滲透液體積的增加，膜平均通量的變化，見圖3。

由圖3可知，滲透通量變化基本上分為了兩個階段，即快速下降區(qū)和緩慢減少區(qū)。在開始滲透通量下降較快，當滲透液量達到300 mL時，滲透通量下降變得緩慢，說明開始濃差極化顯著，當滲透液量達到300mL時，濃差極化基本上達到穩(wěn)態(tài)。理論上在濃差極化層處于穩(wěn)態(tài)，在未造成膜孔堵塞，也沒形成不可逆覆蓋層情況下，滲透通量應該會保持穩(wěn)定，但是在實際操作過程中膜的污染是不可避免的，且會逐漸加重，滲透通量也必定會下降。

2.3 濃縮比對超濾性能的影響

采用單級間歇操作，考察對2000 mL酶解液分別濃縮2、5、8、10倍不同情況下蛋白質的回收率（濃縮液中蛋白質總含量與酶解前底物中蛋白質總含量之比）、通量衰減率、小分子的除去情況（用Superdex 7510/300 GL測定，洗脫液為0.1 mol/L醋酸銨，洗脫流速為0.5 mL/min、上樣體積為 0.5 mL，檢測波長 230 nm[9]。通過預實驗得到11 mL～14 mL收集組分是CGMP）。

表1 不同濃縮比的超濾結果Table1 Ultrafiltration result of different volume concentration ratio

由表1和圖4～圖7可知，小分子物質隨著濃縮比的增加越來越少，直到濃縮比為8倍時，如果繼續(xù)濃縮小分子物質沒有明顯的減少，而蛋白回收率隨著濃縮比的增大在減少，滲透通量衰減率隨著濃縮比的增大在增加。考慮到對膜的保護和目標物的回收率，選擇濃縮比為8。

3 結論

在室溫下對超濾技術分離純化CGMP的條件進行研究，得到超濾最佳條件是壓差為0.02 MPa，濃縮比為8。通過此方法得到了比較純的的CGMP，蛋白回收率為1.77%，糖基化程度（唾液酸/蛋白質）為70.1μg/mg，并且此方法適用于工業(yè)化生產。

[1]高志芳,錢方,陳莉,等.酪蛋白糖巨肽的生理功能及發(fā)展前景[J].食品研究與開發(fā),2007,28(3):183-185

[2]李海平,程濤,霍貴成.乳源糖巨肽的生物活性[J].中國乳品工業(yè),2002,30(5):74-77

[3]吳疆,龐廣昌.酪蛋白糖巨肽的分離純化研究[J].食品科技,2004(4):20-22

[4]劉劍虹,龐廣昌.采用鹽析及Q Sepharose FF分離純化酪蛋白胃蛋白酶水解物中的酪蛋白糖巨肽[J].食品科學,2005,26(8):255-259

[5]張秀媛,袁永俊.凝乳酶水解酪蛋白生產酪蛋白糖巨肽工藝條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2008(4):171-173

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[7]欒雨時,包永明.生物工程實驗技術手冊[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:11-12

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[9]Nakano T,Ozimek L.Purification of Glycomacropeptide from Caseinate Hydrolysate by Gel Chromatography and Treatment with Acidic Solution[J].Food Chemistry and Toxicology,2000,65(4):588-590

Purifing Casein Glycomacropeptide from Chymosin Casein Hydrolysate by Ultrafiltration

HE Kuo1,ZHANG Xiu-yuan1,YUAN Yong-jun2
（1.Department of Food Science,Hebei North College，Zhangjiakou 075131，Hebei,China;2.College of Biological Engineerring,Xihua University,Chengdu 610039,Sichuan,China）

Ultrafiltration conditions with purifing CGMP were studied.Optimum ultrafiltration conditions were gained as follows:differential pressure 0.02 MPa,concentration ratio 8.The way not only prepares more pure CGMP，the rate of recovery of protein 1.08%,the degree of glycosylation（sialic acid／protein）78.9 μg/mg,but also fit for industrialized production.

Casein glycomacropeptide（CGMP）；ultrafiltration；sialic acid

四川省教育廳重點科研項目（07205007）

何擴（1978—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

2009-05-22