丁勝華，歐仕益，趙健，王遠(yuǎn)，胡長鷹

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

利用蔗渣制備低聚木糖的工藝

丁勝華，歐仕益*，趙健，王遠(yuǎn)，胡長鷹

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

從蔗渣中提取木聚糖后，采用酶法水解制備低聚木糖。堿法提取工藝為：NaOH濃度4%，料液比1∶15（g/mL），30.0℃提取24.0 h；在此條件下，木聚糖產(chǎn)率達(dá)20.67%。提取液采用分子量為3000 u的中空纖維超濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮液用清水洗反復(fù)超濾除去殘余堿，獲得濃度為60.17 g/L的木聚糖，采用木聚糖酶進(jìn)行酶解。正交試驗結(jié)果表明，當(dāng)酶量5.0 g/L、pH=6.0，在40.0℃下酶解4.0 h后，可獲得產(chǎn)量達(dá)31.13 g/L，平均聚合度為2.64的低聚木糖。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：堿液可回收再利用，并可分離堿解液中的阿魏酸和香豆酸。

蔗渣；酶法水解；低聚木糖

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展和生活水平的提高，人們健康意識的日益增強(qiáng)，對于日常飲食提出了健康、營養(yǎng)、自然等諸多要求，由此掀起了功能性食品的研究開發(fā)熱潮。低聚木糖又稱木寡糖[1]，由2個～10個木糖通過糖苷鍵連接而成，分子量約為300 u～2000 u。它除具有功能性低聚糖一般的功能性質(zhì)外，還具有顯著的雙歧桿菌增殖效果、耐酸、耐熱、降低水分活度和防止凍結(jié)[2-5]等優(yōu)點(diǎn)。它可選擇性地增殖雙歧桿菌，提高人體免疫力和抗癌能力，抑制外源性病菌對人體地侵入，防治腸道疾病，降低人體膽固醇，促進(jìn)鈣吸收，有利于代謝且不受胰島素的控制，可作為糖尿病和肥胖病患者的甜味劑[5]。20世紀(jì)90年代末以來，低聚木糖已經(jīng)成為國內(nèi)外競相研究開發(fā)的功能性低聚糖之一。低聚木糖一般以玉米芯為原料，先采用堿法制備出木聚糖，再中和、酶解制備出低聚木糖[6-10]，這種工藝耗堿量大，排放的廢水較多；或者對堿提木聚糖采用水的高溫高壓蒸煮自動水解以及添加無機(jī)酸進(jìn)行水解制備低聚木糖[11]，這兩種方法對試驗設(shè)備都有較高的要求，而且制備的水解產(chǎn)物中除低聚木糖外，還含有較多的單糖及其單糖降解物[12]，容易引發(fā)副反應(yīng)，這對后續(xù)低聚木糖的精制工作帶來困難。本研究利用南方特有的蔗渣資源，在較溫和條件下，采用堿提并結(jié)合超濾和酶法制備，達(dá)到既可回收堿液，又可高效制備低聚木糖的目的。

1 材料和方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 試劑

蔗渣取自臺山海宴華僑農(nóng)場糖廠；NaOH、醋酸、木糖、硫酸、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇：均為國產(chǎn)分析純試劑；木聚糖酶購自諾維信（中國）有限公司。

1.1.2 主要儀器

SHA-BA恒溫振蕩器：江蘇省金壇市神科儀器廠；KDC-12低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；中空纖維超濾器：無錫超濾設(shè)備廠；UV-9200紫外/可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 蔗渣前處理

將蔗渣在常溫下用清水浸泡沖洗去除殘余蔗糖，200目尼龍布過濾，晾干，粉碎，收集粉碎的蔗渣置于恒溫干燥箱中60.0℃干燥至恒重，取出放于干燥器中，備用。

1.2.2 木聚糖的提取

分別稱取10.0 g經(jīng)過前處理的蔗渣，置于250 mL三角瓶中，加入150 mL不同濃度的NaOH溶液，搖勻，密封置于30.0℃恒溫振蕩器中以150 r/min振蕩提取24.0 h，然后抽濾，濾液以冰醋酸中和至pH7.0。取適當(dāng)體積溶液于燒杯中，加入4倍體積的95%工業(yè)酒精，密封后4.0℃貯存24.0 h，分離沉淀物，60.0℃干燥至恒重，得到淡黃色或棕色木聚糖。

1.2.3 超濾法制備木聚糖

稱取1 kg經(jīng)前處理的蔗渣置于50 L不銹鋼桶中，加入4%氫氧化鈉15 L，常溫下攪拌提取24.0 h，三足離心機(jī)離心，收集濾液；殘渣用7 L清水洗滌，然后再離心，收集濾液，洗滌重復(fù)兩次。合并濾液過200目的尼龍布，進(jìn)中空超濾機(jī)進(jìn)行超濾濃縮。超濾膜為內(nèi)聚砜膜，分子截留量為3000 u。保持超濾壓力為0.15 MPa進(jìn)行超濾濃縮，濃縮約10倍后，加清水繼續(xù)超濾，直到木聚糖溶液pH降到中性，濃縮液4.0℃貯存，備用；透過液可采用離子吸附交換法制備阿魏酸、香豆酸[13]等酚酸，過柱后的堿液補(bǔ)充適當(dāng)量的堿后可再次用來提取木聚糖。木聚糖制備工藝見圖1。

1.2.4 木聚糖的酶解工藝

以 4%NaOH 溶液、料液比為 1∶15（g/mL），30.0 ℃對經(jīng)前處理的蔗渣提取24.0 h得到木聚糖的堿提液，堿液超濾濃縮后，調(diào)整pH至7.0，低溫貯存，備用。取100 mL濃縮液于250 mL三角瓶中，調(diào)整pH，加入木聚糖酶制劑于渦旋混合器上混勻，保鮮膜封口，置于恒溫振蕩器中150 r/min酶解。一定時間后，取出，沸水浴滅酶20 min，4000 r/min離心30 min，取上層液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測還原糖和總糖。

1.2.5 木聚糖酶酶解正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，取濃度為60.17 g/L木聚糖溶液，以酶添量、酶解溫度、酶解pH和酶解時間為決定變量因素，設(shè)計L9（34）正交試驗，因素水平見表1。

表1 木聚糖酶水解木聚糖L9（34）正交表Table1 L9（34）Orthogonal experiments array of hydrolysis of xylan by pentopan

按照正交表條件反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶20 min，4000 r/min離心30 min，取上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測還原糖和總糖。1.2.6 分析檢測方法

還原糖的測定：采用3，5－二硝基水楊酸法（DNS）法[14]。

總糖的測定：取一定量的樣品離心30 min，取上清液緩慢加入H2SO4，使H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.2%，100℃下反應(yīng)2.0 h，6 mol/LNaOH中和反應(yīng)液，過濾，濾液采用DNS法測定還原糖。

水解液可溶性糖的平均聚合度（DP）=水解液可溶性總糖濃度/水解液還原糖濃度

2 結(jié)果與討論

2.1 氫氧化鈉溶液濃度對提取率的影響

NaOH溶液濃度對木聚糖提取率的影響見圖2。

當(dāng)料液比、提取時間和溫度分別為1∶15（g/mL）、24.0 h和30.0℃時，木聚糖提取率隨NaOH溶液濃度的增高而增加；氫氧化鈉濃度至4%后木聚糖提取率增加緩慢，考慮到后序工藝需調(diào)整pH（太高pH對超濾膜損害大）及低聚木糖液脫色脫鹽，氫氧化鈉溶液的濃度確定為4%。

2.2 料液比對提取率的影響

提取木聚糖時，料液比的范圍為 1∶10～1∶25（g/mL），堿濃度、時間和溫度分別固定在4%、24.0 h和30.0℃。研究木聚糖和堿提時間的關(guān)系試驗結(jié)果如圖3。

從圖 3 可以看出，料液比在 1∶15 和 1∶20（g/mL）之間，提取率隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比在1∶20和 1∶25（g/mL）之間，提取率隨料液比的增加而減少，這是因為料液比大，溶液稀釋了有效成分，也使攪拌不充分提取率偏低，考慮提取率降低成本等因素結(jié)合圖3可以看出，提取木聚糖時以料液比1∶15（g/mL）為宜。

2.3 提取時間對提取率的影響

將料液比固定為 1∶15（g/mL），堿液濃度與堿提溫度為4%和30.0℃。研究不同料液比對木聚糖提取率的關(guān)系，見圖4。

圖4可以看出提取時間8.0 h至16.0 h，提取率增加較快，提取時間大于24.0 h，隨著提取時間的增加，木聚糖的提取率增加緩慢，從試驗結(jié)果看出，提取木聚糖時間確定為24.0 h。

2.4 提取溫度對提取率的影響

將料液比固定為1∶15（g/mL），堿液濃度與堿提時間為4%和24.0 h，研究不同溫度對木聚糖提取率的影響。提取溫度為30.0℃和40.0℃時，木聚糖的提取率分別達(dá)到20.67%和25.30%。隨溫度增高，木聚糖提取液的顏色加深，能源也消耗增大，對提取設(shè)備的要求高。考慮到后續(xù)工藝需脫色和能源消耗等因素，提取溫度采用30.0℃。

在此基礎(chǔ)上，選擇最佳堿解工藝，采用超濾法制備木聚糖，獲得濃度為60.17 g/L的木聚糖溶液，透過液通過離子交換法可制備阿魏酸、香豆酸等酚酸，堿液可用于堿解蔗渣，減少廢水排放和用堿量。

2.5 酶解工藝的確定

2.5.1 木聚糖酶量對低聚木糖生產(chǎn)的影響

為了確定最適酶量，選擇一個濃度范圍的5種不同劑量進(jìn)行反應(yīng)，酶解條件為反應(yīng)溫度為50.0℃，底物濃度為60.17 g/L。pH=5.0,反應(yīng)時間為6.5 h，不同濃度木聚糖酶催化木聚糖水解成低聚木糖的情況如圖5所示。

在酶量為1.0 g/L情況下，水解產(chǎn)物中低聚糖的濃度為21.86 g/L，隨著酶濃度的增大，低聚木糖的濃度也不斷增加。當(dāng)酶量達(dá)到4.0 g/L時，可溶性總糖的濃度增加比較平緩。

2.5.2 底物濃度對低聚木糖生產(chǎn)的影響

研究不同木聚糖濃度（12.03 g/L～60.17 g/L）在相同酶解條件下對低聚木糖生產(chǎn)的影響，反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50.0℃，酶量5.0 g/L，反應(yīng)時間為6.5 h，pH=5.0，結(jié)果見圖6，可知，隨著底物濃度的增加，可溶性總糖和還原糖的含量顯著增加。低底物濃度24.07 g/L時，可溶性總糖濃度相對較小，僅為11.15 g/L，然而，還原糖的濃度卻相對較高，達(dá)到5.45 g/L。在底物濃度為60.17 g/L時，可溶性總糖濃度增加到24.40 g/L，此時的還原糖濃度為10.28 g/L。推測可能因為低底物濃度時，酶與底物接觸充分，隨著底物濃度的增加，酶不易與底物充分接觸，酶解效率下降。繼續(xù)增大底物濃度，超濾困難，不易達(dá)到要求，酶亦不易擴(kuò)散，不利酶解，所以控制底物濃度為60.17 g/L。

2.5.3 時間對低聚木糖生產(chǎn)的影響

研究底物濃度為60.17 g/L時不同時間條件下對低聚木糖生產(chǎn)的影響。反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50℃，酶量5.0 g/L，反應(yīng)時間為6.5 h，pH=5.0，結(jié)果見圖7。

從圖7可以看出，在反應(yīng)時間12.0 h內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，可溶性總糖和還原糖的濃度都增大。當(dāng)反應(yīng)時間由6.0 h延長到12.0 h，可溶性總糖濃度增加相對緩慢。在反應(yīng)2.0 h后，底物酶解后其平均聚合度迅速降到2.58，在4.0 h～12.0 h，酶解產(chǎn)物的平均聚合度從2.56緩慢均勻地降到2.12。推測可能是因為酶解產(chǎn)物對木聚糖酶有抑制作用。

2.5.4 pH對低聚木糖生產(chǎn)的影響

研究了底物濃度為60.17 g/L、pH=4.0～7.0時酶解對生產(chǎn)低聚木糖的影響。反應(yīng)條件為：酶量5.0 g/L，反應(yīng)溫度為50.0℃，反應(yīng)時間為6.5 h，結(jié)果見圖8。

從圖8可看出，在pH=5.5時，可溶性總糖及還原糖比其它pH條件下產(chǎn)生的濃度相對較高。酶解產(chǎn)物的聚合度為2.23。

2.5.5 溫度對低聚木糖生產(chǎn)的影響

研究了底物濃度為60.17 g/L木聚糖酶在pH=5.0、溫度40.0℃～60.0℃對生產(chǎn)低聚木糖的影響。反應(yīng)條件為：酶量5.0 g/L,pH=5.0,反應(yīng)時間為6.5 h，結(jié)果見圖9。

從圖9看，溫度在45.0℃～55.0℃的酶解產(chǎn)物的可溶性總糖的濃度較40.0℃和60.0℃條件下產(chǎn)生的可溶性總糖濃度高。

2.5.6 酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化

正交試驗和極差分析結(jié)果如表2,由表2可以看出各因素的極差（R）的大小為D（酶解時間）>C（酶解pH）>B（酶解溫度）>A（酶量）。其中最佳反應(yīng)條件是A3B1C3D2,即：酶添量 5.0 g/L、溫度 40.0 ℃、pH=6.0，反應(yīng)時間 4 h，此時可溶性總糖濃度為（31.13±0.58）g/L，此時的平均聚合度為2.64。

表2 木聚糖酶水解木聚糖正交試驗結(jié)果Table2 The result of the orthogonal test

3 結(jié)論

1）通過單因素試驗初步得利用蔗渣堿提木聚糖的條件為：4%NaOH、料液比 1∶15（g/mL）、提取時間 24.0h、溫度30.0℃。在此條件下從蔗渣中提取木聚糖的提取率達(dá)20.67%。

2）通過正交試驗得出木聚糖酶催化水解木聚糖最佳條件為:酶添量5.0 g/L、溫度40.0℃、pH=6.0，反應(yīng)時間4.0 h。在此條件下水解堿提木聚糖的可溶性總糖為31.13 g/L，其平均聚合度為2.64。

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Preparation of Xylooligosaccharides from Sugarcane Bagasse

DING Sheng-hua，OU Shi-yi*，ZHAO Jian，WANG Yuan，HU Chang-ying
（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，Guangdong，China）

Xylan was extracted from sugarcane bagasse and used to prepare xylooligosaccharides by enzymatic hydrolysis.20.67%xylan was recovered when sugarcane bagasse was extracted with 15 volume of 4%NaOH（g/mL）at 30.0℃ for 24.0 h.The alkali hydrolysate was ultrafiltrated using hollow fiber ultrafiltrator with a 3000 u molecular cutoff and the concentrate was washed by tap water to remove residual alkaline.The concentratewhichcontained60.17g/Lxylanwashydrolysedbypentopan.Theorthogonaltestshowedthat31.13g/L of xylooligosaccharides with average DP 2.64(degree of polymerization)was produced when 5.0 g/L of pentopan was added and reacted at 40.0℃，pH6.0 for 4.0 h.The advantage of this technology is that the alkaline could be recycled and ferulic acid and coumaric acid in the hydrolysate could be recovered.

bagasse；enzymatic hydrolysis；xylooligosaccharides

廣東高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化重大項目（cgzhzd0709）

丁勝華(1985—)，男(漢)，碩士研究生，研究方向:功能食品。

*通訊作者：歐仕益(1963—)，男，教授，從事食品化學(xué)與功能食品的研究。

2009-08-04