譚 宏，劉選明，廖紅東，謝 驪，梁志坤，廖勝輝，紀鴻雁莫湘濤，鄧 樂，王 鑫,朱立超,張元戎

(1.湖南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)研究院，中國 長沙 410082;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙 410081)

纖維素酶(Cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱[1-2]．纖維素酶在食品、飼料、紡織、農(nóng)產(chǎn)品加工、石油開采和資源再生等方面具有廣泛的用途和應(yīng)用前景；特別是在利用廢棄秸稈生產(chǎn)酒精的生物能源開發(fā)方面，具有巨大的潛在價值．湖南省農(nóng)業(yè)資源優(yōu)勢明顯，每年僅稻草的產(chǎn)量就有數(shù)千萬噸；合理利用與轉(zhuǎn)化這些纖維素資源對于解決工農(nóng)業(yè)原料來源、能源危機、環(huán)境污染等具有重要的意義．本文選用液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株里氏木霉HC-415[3]，在搖瓶階段，通過正交試驗等對稻草培養(yǎng)基中稻草粉與豆粕粉的用量、一級種接種量、一級種培養(yǎng)時間、二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間、通氣量、無機鹽等因素進行了研究，確定了優(yōu)化的培養(yǎng)基配方和產(chǎn)酶條件．為利用稻草液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究提供了基礎(chǔ)的實驗依據(jù)．現(xiàn)將結(jié)果報導(dǎo)如下．

1 材料和方法

1.1 菌種

里氏木霉(Trichoderma reesei) HC-415．

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基．

1.2.2 一級種搖瓶培養(yǎng)基 麩皮0.02 g/mL，葡萄糖0.03 g/mL，(NH4)2SO40.001 5 g/mL，pH 5.5～6.0．

1.2.3 二級產(chǎn)酶搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基 稻草粉，豆粕粉，無機鹽等，pH 5.5～6.0．

1.3 主要儀器設(shè)備

722S分光光度計；電熱恒溫水浴鍋；Universal 32R 臺式冷凍離心機；HZQ-Q全溫搖瓶柜．

1.4 酶活性測定方法

1.4.1 羧甲基纖維素酶活性(CMC’ase)測定 DNS法，0.5 mL適當稀釋的酶液加入0.005 g/mL CMC-Na溶液1.5 mL．50 ℃ 酶解30 min，加3 mL DNS試劑．沸水浴10 min顯色,測還原糖．

1.4.2 濾紙?zhí)敲富钚?FPA)測定 參照Mandels、蔣傳葵 DNS法[4]．1 mL適當稀釋的待測酶液，加入1 mL 0.05 mol/L(pH 4．6)檸檬酸鹽緩沖液和1條1 cm×6 cm新華1號濾紙．50 ℃酶解1 h， 加DNS試劑3 mL，沸水浴10 min．顯色測還原糖， 扣除空白后計算酶活性．

酶液活性單位規(guī)定：1 h水解生成1 mg葡萄糖的酶量為1個活性單位(U)．

2 結(jié)果與討論

2.1 二級產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉的用量對纖維素酶活性的影響

參照文獻[3]，此試驗中一級種制備為：250 mL三角瓶中，一級種培養(yǎng)基裝量100 mL,28～30 ℃全溫搖瓶柜中150 r/min培養(yǎng)40 h．二級產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：250 mL三角瓶中，培養(yǎng)基裝量100 mL；無機鹽KH2PO40.005 g/mL，CaCl20.003 g/mL，不加聚醚；一級種接種體積分數(shù)為10%,(30±1) ℃全溫搖瓶柜中140～170 r/min培養(yǎng)144 h．產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉的用量對纖維素酶活性的影響見表1．

表1 二級產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉用量對纖維素酶活性的影響

從表1可知，稻草粉與豆粕粉的質(zhì)量比為4∶1時，CMC’ase酶活性較高，平均為85.88 U/mL；6∶1時，F(xiàn)PA酶活性較高，平均為9.8 U/mL．盡管本實驗中，用豆粕粉代替了以前使用的豆餅粉，但稻草粉與豆粕粉的質(zhì)量比仍與以前一樣．表明作為氮源的豆餅粉與豆粕粉可以互換使用．在后面的試驗中，作者選定的產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉質(zhì)量比為6∶1．

2.2 一級種接種量等對纖維素酶活性影響的正交試驗

采用L9(34)正交表，對一級種接種量、培養(yǎng)時間、二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間和通氣量4因素作搖瓶正交試驗．二級產(chǎn)酶培養(yǎng)基中KH2PO40.005 g/mL，CaCl20.003 g/mL；聚醚不加．

2.2.1 實驗因素水平安排 見表2，正交試驗共進行了兩批次．

表2 一級種接種量等正交試驗因子及水平安排表

2.2.2 實驗結(jié)果及分析 對正交試驗各搖瓶編號的提取酶液，分別測定CMC’ase及FPA酶活性．分析時同時采用極差分析與方差分析的方法[5]．所得結(jié)果見表3和表4．

表3 一級種接種量等因子搖瓶正交試驗CMC酶活性結(jié)果分析

從表3看，一級種接種量等因子對CMC’ase的影響，通過極差分析其順序為D>B>A>C,最佳配方為D1B3A2C1；方差分析的顯著性順序與極差分析一致．從表4看，一級種接種量等因子對FPA酶活性的影響，極差分析與方差分析的順序均為D>B>C>A,最佳配方則為D1B3C1A2．

表明在稻草培養(yǎng)基中，通氣量與產(chǎn)酶發(fā)酵時間對纖維素酶的生成具有重要作用，尤其是通氣量的作用最為顯著，通氣量D1表明HC-415菌液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶時，耗氧量較高，這是與以前報道不一致的地方[3]．產(chǎn)纖維素酶最佳組合：一級種接種體積分數(shù)為15%，二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間168 h，一級種培養(yǎng)時間24 h，通氣裝瓶量50 mL．對比9號實驗數(shù)據(jù)，兩者結(jié)果基本吻合；CMC’ase酶活性最高平均為85.56 U/mL； FPA酶活性最高平均為11.78 U/mL．

表4 一級種接種量等因子搖瓶正交試驗FPA酶活性結(jié)果分析

2.3 無機鹽等因素對纖維素酶活性影響的正交試驗

以上述實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，采用L9(34)正交表，進一步研究了二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間、培養(yǎng)基中KH2PO4、CaCl2、聚醚對纖維素酶活性的影響．此正交試驗中一級種接種體積分數(shù)為15%，一級種培養(yǎng)時間24 h，二級產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝瓶量為在250 mL三角瓶中裝入50 mL．

2.3.1 實驗因素水平安排 見表5．正交試驗共進行了兩批次．

表5 無機鹽等正交試驗因子及水平安排表

2.3.2 實驗結(jié)果及分析 對本正交試驗各搖瓶編號的提取酶液，分別測定CMC’ase及FPA酶活性．分析時采用極差分析與方差分析的方法．所得結(jié)果見表6和表7．

表6 無機鹽等因子搖瓶正交試驗CMC酶活性結(jié)果分析

表7 無機鹽等因子搖瓶正交試驗FPA酶活性結(jié)果分析

從表6看，無機鹽等因子對CMC’ase的影響，通過極差分析其影響順序為C>B>A>D,最佳配方為C3B3A1D1；方差分析的顯著性順序與極差分析一致．從表7看，無機鹽等因子對FPA酶活性的影響，極差分析與方差分析的影響順序則為B>C>A>D,最佳配方為B3C3A1D1．表明稻草培養(yǎng)基中，KH2PO4與CaCl2對纖維素酶的生成具有重要作用，而產(chǎn)酶發(fā)酵時間則排到了第三位，聚醚的影響不顯著．CaCl2對CMC’ase的生成最重要；而KH2PO4對FPA酶的生成最重要．產(chǎn)纖維素酶最佳組合為：KH2PO40.01 g/mL，CaCl20.006 g/mL，二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間120 h，聚醚不加．對比3號實驗數(shù)據(jù)，兩者結(jié)果基本吻合；CMC’ase酶活性最高平均為94.62 U/mL； FPA酶活性最高平均為16.04 U/mL．有文獻報道[6]，聚醚作為表面活性劑，一是可以消泡，二是能促進酶分子從菌體表面加速擴散到發(fā)酵液里，使酶合成的動態(tài)平衡向產(chǎn)酶方向移動，從而增加酶的活性．但本試驗中聚醚的影響屬于不顯著，這是與報道不一致的地方．從表6、表7看，D列的K1、K2及K3值的分布不太合規(guī)律．因此，作者認為聚醚對HC-415菌的產(chǎn)酶作用不會太簡單，值得今后進一步研究．另外經(jīng)此優(yōu)化后，二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間由2.2中最佳的168 h縮短至120 h，無疑有利于今后工業(yè)化的生產(chǎn)．

3 結(jié)論

(1) 采用搖瓶平行試驗與正交試驗相結(jié)合研究培養(yǎng)基的優(yōu)化組成問題，對于以后利用里氏木霉HC-415菌在發(fā)酵罐中進行稻草液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)化試驗具有重要的指導(dǎo)意義．優(yōu)化后的培養(yǎng)基組合能明顯提高纖維素酶的活性并縮短發(fā)酵時間．

(2) 底物濃度及C/N 對纖維素酶的產(chǎn)生有較大的影響[7]．由2.1實驗結(jié)果，可知里氏木霉HC-415菌對稻草培養(yǎng)基固形物的濃度要求為0.05～0.07 g/mL．超過0.09 g/mL時，酶活性顯著降低．產(chǎn)酶培養(yǎng)基中稻草粉與豆粕粉最佳用量比例為4∶1～6∶1．

(3) 綜合2.2及2.3實驗結(jié)果，可知里氏木霉HC-415菌利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶時，培養(yǎng)基的通氣量、無機鹽KH2PO4、CaCl2和二級產(chǎn)酶發(fā)酵時間對纖維素酶的生成具有顯著性的影響．優(yōu)化后的稻草培養(yǎng)基最佳產(chǎn)酶時間能縮短2 d．

(4) 表面活性劑聚醚在本實驗中對里氏木霉HC-415菌利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響不顯著，其機理有待進一步的深入研究．

參考文獻：

[1] WOOD T M, MCCRAE S l. Sinergism between enzymes involvement in the solubilization of native cellulose[J].Adv Chem Ser， 1979,18(1):181-209.

[2] LEE R L, PAUL J. Microbial cellulase utilization：fundamentals and biotechnonlgy[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2002,(9):506-577.

[3] 譚 宏，謝小保，莫 勇. 里氏木霉液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究[J].工業(yè)微生物，1996，26(1)：7-11.

[4] 蔣傳葵.工具酶活力測定[M].上海：上海科學(xué)出版社,1982.

[5] 陳和利.正交設(shè)計資料方差分析簡便計算法[J].藥物流行病學(xué)雜志,1998,7(1):40-42.

[6] 黃彬漢. 聚醚對提高纖維素酶的活力初步研究[J].微生物學(xué)通報,1987,14(1):6-8.

[7] JIRKU V. Effect of C/N ratio and cellulose type on the cellulolytic activity of free and immobilized Trichoderma reesei[J]. Prog Biotechnol,1996,(11):136-139.