張海元，許光華，張 靜

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

MS-275增強順鉑致肝癌細胞凋亡效應的實驗研究

張海元，許光華，張 靜

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

目的：探討MS-275與化療藥物順鉑(cisplatin,DDP)聯合應用對肝癌細胞系HLE增殖的抑制效果。方法：通過MS-275聯合化療藥物順鉑處理培養(yǎng)的肝癌細胞系HLE，體外細胞毒性實驗(MTT)法檢測細胞增殖抑制率，流式細胞術(FCM)檢測細胞周期和凋亡率。結果：MTT結果顯示：0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯合應用后5d，HLE細胞增殖抑制率達(97.86±5.62)%，明顯高于單用MS-275組的(51.75±2.31)%和DDP組的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)。流式細胞術結果顯示：MS-275與DDP聯合應用明顯導致細胞S期減少，G2/M期阻滯；MS-275聯合DDP組細胞凋亡率為(17.46±2.57)%，明顯高于單用MS-275組的(7.62±0.59)%和DDP組的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)。結論：MS-275與DDP聯合應用能顯著提高對肝癌細胞系HLE增殖的抑制作用。

肝癌；細胞系；MS-275；順鉑；基因治療

順鉑(cisplatin，DDP)是臨床應用最為廣泛的一種抗腫瘤藥物。鉑類藥物的主要作用機制是通過損傷DNA, 使細胞進入G1期生長抑制，并誘導損傷嚴重的細胞進入凋亡狀態(tài)[1]。但順鉑副作用較大，順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴重損害，另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時易引起耐藥性，故使得順鉑應用于肝細胞癌的治療效果并不理想。MS-275屬于苯甲酰胺類HDACs抑制劑，可上調p21基因的表達，對多個小鼠的人腫瘤模型都表現出強烈的抑瘤作用[2]，但將MS-275和化療藥物順鉑聯合應用于肝癌細胞國內外尚無報道。本實驗擬采用低劑量的順鉑和MS-275聯合應用，以探討其是否具有協同作用，從而減少肝癌患者順鉑的使用劑量，減少順鉑的毒副作用，增強患者的耐受性。通過本項目中MS-275與順鉑聯合應用對肝癌細胞系HLE影響的效果及機制的探討，有望獲得全新的聯合抗肝癌的藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1材料肝癌細胞系HLE由新加坡國立大學腫瘤研究所饋贈，細胞接種于含10%新鮮牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，RPMI1640培養(yǎng)液及二甲亞砜(DMSO)購自美國GIBCO公司。DDP購于錦州九泰藥業(yè)公司,MS-275購自德國Merck公司。

1.2方法

1.2.1 HLE細胞培養(yǎng) 將肝癌細胞系HLE接種于含10%新生牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2及飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用0.125%的胰蛋白酶消化傳代，1～2d換液一次。

1.2.2 體外細胞毒性實驗法(MTT)檢測肝癌細胞系HLE的增殖情況 將細胞接種于96孔板，設對照組、MS-275(0.5μmol/L)組、DDP(6.25μg/ml)組及MS-275+DDP聯合治療組，每孔加入MTT液20μl，于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，各孔加200μl二甲基亞楓，用酶聯儀在570nm波長下檢測每孔的光密度(D)，每組重復3板，計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率(%)=[(1-實驗組D值)/對照組D值]×100%。

1.2.3 流式細胞術(FCM)檢測肝癌細胞系HLE的細胞周期和細胞凋亡情況 HLE細胞經單純加入

DDP(6.25μg/ml)或MS-275(0.5μmol/L)及MS-275與DDP聯合應用,48h后收集所有貼壁和懸浮細胞，用10mmol/L PBS(pH7.4)洗滌兩次，通過流式細胞儀分析細胞周期和細胞凋亡情況。

2 結 果

2.1各組藥物對肝癌細胞系HLE的生長抑制率檢測結果顯示，0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯合應用120h后，HLE細胞增殖抑制率達(97.86±5.62)%，明顯高于僅用MS-275組的(51.75±2.31)%及DDP組的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)。見表1。

表1 各組藥物對HLE細胞增殖的抑制作用 %

注：MS-275+DDP組與MS-275組或DDP組比較，均Plt;0.05。

2.2流式細胞術檢測HLE細胞周期和細胞凋亡率0.5μmol/L MS-275可導致HLE細胞S期減少、G2/M期阻滯，而MS-275與6.25μg/ml DDP聯用后，對HLE細胞的S期減少、G2/M期阻滯更明顯。當0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯用60h后，HLE細胞凋亡率達(17.46±2.57)%，明顯高于單用MS-275組的(7.62±0.59)%和DDP組的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)。見表2。

表2各組藥物對HLE細胞周期及凋亡的影響%

組 別G0/G1SG2/M凋亡率對照組5131±2893285±2471052±147091±026MS?275組6138±2551336±0871928±135762±059DDP組6278±3632139±175951±166736±047MS?275+DDP組5642±351483±2713142±2541746±257

注：MS-275+DDP組與MS-275組或DDP組比較，均Plt;0.05。

3 討 論

肝細胞癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生是一個多因素、多階段、多基因變異的積累過程。肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展不僅存在細胞增殖與分化的異常，也與細胞凋亡異常、Runx3 基因啟動子區(qū)域異常甲基化密切相關[3-4]。MS-275是一種較新的苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑(HDACIs)，有誘導腫瘤細胞增殖阻滯、分化和凋亡以及選擇性地作用于腫瘤細胞等抗癌活性。據報道[5-6]，MS-275已被證實對白血病和實體瘤表現出良好的療效，不良反應的發(fā)生率極低，發(fā)生程度亦較輕，說明與傳統的化療藥物相比，MS-275具有較大的優(yōu)勢。本課題組在前期的實驗中證明MS-275在肝癌細胞系Hep3B中能誘導p21WAF1/CIP1表達，加速腫瘤細胞凋亡[7]，并對多個小鼠的人腫瘤模型上都表現出強烈的抑瘤作用。Sato等[8]應用MS-275聯合順鉑治療口腔鱗狀細胞癌，證實兩類藥物可通過不同途徑作用于腫瘤細胞，具有協同作用，對化療藥物起到減毒增效的功效。

本實驗通過MTT和FCM檢測到了MS-275與化療藥物DDP單用或聯合應用時對肝癌細胞系HLE增殖的抑制作用。MTT檢查結果顯示，0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯合應用后5d，HLE細胞增殖抑制率達(97.86±5.62)%，顯著高于單用MS-275組的(51.75±2.31)%和DDP組的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)，說明苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑MS-275與低劑量化療藥物順鉑聯合應用后，能明顯誘導肝癌細胞增殖抑制。FCM結果顯示，MS-275與DDP聯合應用明顯導致細胞S期減少，G2/M期阻滯；MS-275聯合DDP組細胞凋亡率為(17.46±2.57)%，顯著高于單用MS-275組的(7.62±0.59)%和DDP組的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)，說明MS-275與順鉑聯合應用，可能通過上調p21基因表達，阻止腫瘤細胞進入S期，使其停滯于G1期，同時發(fā)生G2/M期阻滯，腫瘤細胞凋亡率明顯增強。由本實驗結果推測，MS-275與DDP聯合應用時其抑制腫瘤細胞增殖的機制可能與細胞周期阻滯及上調凋亡作用有關。因此，MS-275與化療藥物DDP在肝細胞癌的治療上有一定的互補作用，能提高肝細胞癌的療效，并通過降低化療藥物的用量，從而減少其毒副作用及耐藥性。

組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)類藥物和化療藥物合用已經成為最近腫瘤治療界的研究熱點，該研究的方向是通過HDACIs類藥物增加腫瘤細胞對化療藥物順鉑的敏感性起到增效的目的。通過本實驗發(fā)現MS-275與順鉑聯合應用明顯優(yōu)于單獨用藥組，其作用機制除了通過增強促進HLE細胞周期阻滯和凋亡作用外，可能還與HDACIs類藥物本身特性有關。HDACIs類藥物能導致組蛋白乙?；谷旧|處在一種開放的構象上，會促使順鉑等以DNA為作用靶點的化療藥物更易接近核小體之間的DNA連接區(qū)，從而更易發(fā)揮作用[9]。本實驗聯合應用MS-275及化療藥物順鉑處理肝癌細胞，為肝細胞癌的治療提供了新的靶點和全新的聯合用藥方案。

[1]Siddik ZH.Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance[J].Lung Cancer， 2002，38：217.

[2] Kasman L，Lu P，Voelkel-Johnson C.The histone deacetylase inhibitors depsipeptide and MS-275， enhance TRAIL gene therapy of LNCaP prostate cancer cells without adverse effects in normal prostate epithelial cells[J].Cancer Gene Ther，2007，14(3)：327-334.

[3] Haurie V，Ménard L，Nicou A，etal.Adenosine triphosphatase pontin is overexpressed in hepatocellular carcinoma and coregulated with reptin throμgh a new posttranslational mechanism[J].Hepatology，2009，50(6)：1871-1883.

[4] 張海元, 蘇波.5-Aza-CdR激活肝癌細胞Runx3 基因表達及其臨床意義[J].長江大學學報：自科版醫(yī)學卷，2008，5(4)：9-11.

[5] Sakajiri S，Kumagai T，Kawamata N，etal.Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines[J].Exp Hematol，2005，33(1)：53-61.

[6] Garcia-Manero G，Issa JP.Histone deacetylase inhibitors： a review of their clinical status as antineoplastic agents[J].Cancer Invest，2005，23(7)：635.

[7] Zhang HY，Chen P，Bai S，etal.The Histone Deacetylase Inhibitor MS-275 Induces p21WAF1/CIP1 expression in Human Hep3B Hepatoma cells[J].Drug Development Research,2007，68(2)：61-70.

[8]Sato T，Suzuki M，Sato Y，etal.Sequence-dependent interaction between cisplatin and histone deacetylase inhibitors in human oral squamous cell carcinoma cells[J].Int J Oncol，2006，28(5)： 1233-1241.

[9] Johnstone RW.Histone-deacetylase inhibitors： novel drugs for the treatment of cancer[J].Nat Rev Cancer，2002，1(4)：287-299.

[編輯] 一 凡

2010-08-29

大學生創(chuàng)新性實驗項目(國家級)(091048930)

張海元(1974-)，男，湖北鄂州人，講師，碩士，從事腫瘤分子生物學教學與研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.04.001

R735.7

A

1673-1409(2010)04-R001-03