蔡曉月,李培琴,單體江,徐利劍,胥 巖,周立剛

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193

盾葉薯蕷內(nèi)生真菌Dzf13抗細(xì)菌活性成分

蔡曉月,李培琴,單體江,徐利劍,胥 巖,周立剛＊

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193

采用活性追蹤分離的方法,從盾葉薯蕷內(nèi)生真菌菌株 Dzf13中分離到兩個具抗細(xì)菌活性的化合物 1和2,經(jīng)理化和波譜分析鑒定為麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇 (1)和 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇 (2)。結(jié)果表明,化合物 1和 2對根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌和番茄瘡痂病菌等三種植物病原細(xì)菌的生長均表現(xiàn)出一定的抑制活性,尤其對黃瓜角斑病菌的抑制活性較強(qiáng)。結(jié)果還表明 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇 (2)的抗細(xì)菌活性要比麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)強(qiáng)。

盾葉薯蕷;內(nèi)生真菌Dzf13;抗細(xì)菌活性成分;抗細(xì)菌活性

植物內(nèi)生真菌 (Plant endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織或器官內(nèi)部,其宿主植物不表現(xiàn)出外在病害癥狀的真菌[1,2]。大量研究結(jié)果表明,幾乎所有植物中都有內(nèi)生菌的存在,由于長期的協(xié)同進(jìn)化,這些內(nèi)生菌與宿主植物形成了互惠共生的關(guān)系[3,4]。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物,具有促進(jìn)植物生長、提高宿主植物抗性等生理生態(tài)功能,其中內(nèi)生菌普遍存在著抗菌活性[2,5-8]。由于研究內(nèi)生真菌中抗菌活性物質(zhì)具有十分重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景,近年來這方面的進(jìn)展十分迅速,尤其是從內(nèi)生真菌中篩選到許多具有抗菌活性的化合物[2,6,7]。采用 TLC-自顯影并結(jié)合各種色譜方法能有效地從內(nèi)生真菌提取物中獲得抗菌活性成分[9]。

盾葉薯蕷 (D ioscorea zingiberensisC.H.W right)為薯蕷科 (Dioscoreaceae)薯蕷屬多年生藥用植物,主要分布在中國的陜西、江西、湖北、湖南、四川等地,以根狀莖入藥[10]。本研究小組已對盾葉薯蕷內(nèi)生真菌及其抗菌活性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)生真菌具有抗菌活性[11-16]。尚未見盾葉薯蕷內(nèi)生真菌甾體類抗菌化合物的研究報道。本研究從盾葉薯蕷內(nèi)生真菌菌株Dzf13中追蹤分離具抗菌活性的甾體化合物并對其抗細(xì)菌活性進(jìn)行評價,以便將來有效地利用內(nèi)生真菌中的抗菌活性成分。

1 材料與方法

1.1 內(nèi)生真菌

內(nèi)生真菌菌株Dzf13于 2005年從野生健康的 5年生盾葉薯蕷 (D ioscorea zingiberensisC.H.W right)根狀莖中分離得到,盾葉薯蕷根狀莖采自陜西,由武漢大學(xué)李家儒教授鑒定。內(nèi)生真菌Dzf13的形態(tài)特征為:菌落致密,白色,凸起,菌絲短絨毛狀,生長緩慢,菌落背面灰色,未見產(chǎn)孢。通過 rDNA分子鑒定,其 ITS序列與管蘭伯盤菌 (Lam bertella tubulosa)的 ITS序列相似度為 97.0%,提交 Dzf13序列到GenBank核酸序列庫中獲得序列號為 EU543256[11]。Dzf13菌種現(xiàn)保存在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系。

1.2 儀器與試劑

XT4-100顯微熔點儀 (北京科儀電光儀器廠),溫度計未校正;Bruker Avance DPX 300型核磁共振儀,CDCl3為溶劑,T MS為內(nèi)標(biāo);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);VSP-3050型中壓液相色譜儀(東京理化器械株式會社);Bio-Rad 550型多孔板分光光度計。

柱層析硅膠(200±300目)和薄層硅膠板(青島海洋化工有限公司);Sephadex LH-20和反相硅膠RP-18(Pharmacia公司);噻唑藍(lán) (MTT,美國 Amresco公司);硫酸鏈霉素 (Serva公司);其他試劑均為分析純。

1.3 化合物分離與純化

1000 mL體積的三角瓶中盛 300 mL馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基 (PDB),將預(yù)先培養(yǎng)好的 Dzf13菌絲接種到已滅菌的培養(yǎng)基中,在 25℃、150 r/min下暗培養(yǎng) 14 d,得總發(fā)酵液 50 L,過濾得菌絲和菌液。菌液減壓濃縮,依次用等體積的石油醚 (重復(fù) 3次)和正丁醇(重復(fù) 3次)萃取;菌絲陰干后用丙酮提取3次,濃縮后用水混懸,依次用等體積的石油醚 (重復(fù) 3次)和正丁醇 (重復(fù) 3次)萃取。通過 TLC檢測,菌絲和菌液中石油醚萃取部分所含成分一致,合并后減壓濃縮得石油醚萃取物 21 g;菌絲和菌液中正丁醇萃取部分所含成分一致,合并后減壓濃縮得正丁醇萃取物 15 g。經(jīng) TLC-生物自顯影檢測[9],石油醚部分和正丁醇部分均含有抗菌活性成分。

石油醚部分經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-丙酮梯度洗脫:1:0?0:1,v/v)、Sephadex LH-20凝膠柱層析和重結(jié)晶,得化合物 1(15 mg);正丁醇部分經(jīng)正相硅膠柱層析 (氯仿-甲醇梯度洗脫:10:1?1:10, v/v)、SephadexLH-20凝膠柱層析、反相硅膠柱層析和重結(jié)晶,得化合物 2(35 mg)。經(jīng)理化和波譜分析并與文獻(xiàn)對照,化合物 1和 2分別鑒定為麥角甾-5, 7,22-三烯-3β-醇[18]和 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇[19]。

1.4 供試細(xì)菌及其培養(yǎng)

供試細(xì)菌有:根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tum efaciens;縮寫為 A.t.)、黃瓜角斑病菌 (Pseudom onas lachrym ans;縮寫為 P.l.)和番茄瘡痂病菌(Xanthom onas vesicatoria;縮寫為 X.v.),由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系提供。上述供試的植物病原細(xì)菌菌株長期保存在-20°C下,在抗菌活性測定前,需要進(jìn)行菌種活化。供試細(xì)菌在LB(酵母浸膏5 g/L、蛋白胨 10 g/L、氯化鈉 5 g/L;pH 7.0)平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)(28°C,暗)48 h,然后挑取單菌落,在 LB液體培養(yǎng)基中搖培 (28°C,暗,150 r/min)24 h,然后用血球計數(shù)板將菌液濃度調(diào)到 108 cfu/mL,即可用于活性測定。

1.5 抗細(xì)菌活性測定

采用多孔板-MTT顯色法測定化合物對細(xì)菌的最低抑制濃度 (M IC)值[16]。具體步驟如下:在潔凈無菌的 96孔培養(yǎng)板中加入濃度為 106cfu/mL的供試菌液 90μL,然后加入不同濃度梯度的化合物母液 10μL,溶劑(丙酮)終濃度為 10.0%。同時設(shè)陽性對照、空白對照和溶劑對照,每個處理 6個重復(fù)。將 96孔板于 28℃下,振蕩(15 r/min)、暗培養(yǎng) 24 h后每孔中加入MTT溶液 (5 mg/mL)10μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后,在 1500 g下離心 20 min,去上清,每孔加入DMSO 150μL,振蕩(15 r/min)30 min,以終止反應(yīng)并助其溶解。肉眼即可觀察判斷化合物的M I C值,即培養(yǎng)基中剛好無藍(lán)色物質(zhì)生成的藥劑濃度。為了進(jìn)一步驗證M IC值,從多孔板每個孔中吸取 10 μL培養(yǎng)液涂布到 LB平板上,在 28℃下培養(yǎng) 24 h后觀察統(tǒng)計平板菌落數(shù)。

采用多孔板-MTT-分光光度法測定化合物對細(xì)菌的半抑制濃度 (IC50)值[17]。具體步驟如下:加入DMSO終止反應(yīng)之前的步驟同于M I C值的測定。將顯色的菌懸液在 1500 g下離心 20 min,將上清(100 μL DMSO)轉(zhuǎn)移至另一干凈的 96孔板中,采用多孔板分光光度計測定 590 nm處的光吸收值,計算出抑制率(%)。再根據(jù)抑制率,查幾率值表,可得抑制率機(jī)率值 (y),將化合物濃度 (μg/mL)換算成濃度對數(shù)(x),即可求出線性方程 y=ax+b,根據(jù)線性方程可求出半抑制濃度 (IC50)。

2 結(jié)果與分析

通過多孔板-MTT顯色法測定化合物對細(xì)菌的M IC,并采用多孔板-MTT-分光光度法測定化合物對細(xì)菌的 IC50,結(jié)果(表 1)表明,麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)和 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)對三種供試植物病原細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性,尤其是對黃瓜角斑病菌的抗性比較強(qiáng)。同時, 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)的抗細(xì)菌活性要比麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)強(qiáng)。

表 1 麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇和 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇對細(xì)菌的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of ergosta-5,7,22-trien-3β-ol and 5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol on bacteria

3 討論

從 TLC-自顯影結(jié)果看,麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(1)和 5α,8α-過氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)是內(nèi)生真菌Dzf13中的兩個主要抗菌活性成分,但還有其他抗細(xì)菌活性成分 (極性大的部分)未被分離出來,值得進(jìn)一步研究。5α,8α-過氧麥角甾-6, 22-二烯-3β-醇 (2)較麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇 (1)具有更強(qiáng)的抗細(xì)菌活性,這可能與其含有的過氧基團(tuán)有關(guān)。Li等從狗牙根 (Cynodon dactylon)內(nèi)生曲霉 (Aspergillussp.)CY725中也分離到化合物 1和2,它們對幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)均具有很好的抑制活性[20]。隨后,Dai等從加拿利刺柏 (Juniperus cedre)的內(nèi)生真菌 N odulisporium sp.中也分離到上述兩甾體成分,但未報道它們的抗細(xì)菌活性[8]。內(nèi)生真菌 Dzf13存在于盾葉薯蕷體內(nèi),產(chǎn)生抗菌活性成分的生理生態(tài)功能值得深入研究。本研究結(jié)果將為利用盾葉薯蕷內(nèi)生真菌Dzf13生產(chǎn)抗菌活性成分提供依據(jù)。

致謝:武漢大學(xué)李家儒教授和湖北大學(xué)陳永勤教授提供盾葉薯蕷材料,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院王明安教授在化合物結(jié)構(gòu)解析方面給予支持,在此表示感謝。

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Antibacterial Compounds from the Endophytic Fungal Isolate Dzf13 Associated withD ioscorea zingiberensis

CA IXiao-yue,L I Pei-qin,SHAN Ti-jiang,XU Li-jian,XU Yan,ZHOU Li-gang＊
College of Agronomy and B iotechnology,China AgriculturalUniversity,Beijing 100193,China

Two antibacterial compounds,ergosta-5,7,22-trien-3β-ol and 5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol,were isolated and identified by bioassay-guided fractionation from the extract of the endophytic fungal isolate Dzf13 from the rhizomes ofD ioscorea zingiberensis,a dioscoreaceousmedicinalplant.Both two compoundswere screened and have inhibitory activity on plant pathogenic bacteria such as Agrobacterium tumefaciens,Pseudomonas lachrymans and Xanthomonas vesicatoria by using themicroplate-MTT colorimetric assay.Of three bacterialpathogens,P.lacrymanswasmost effectively inhibited.In addition,5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-olwas found to be more bioactive than ergosta-5, 7,22-trien-3β-ol.

D ioscorea zingiberensis;endophytic fungal isolate Dzf13;antibacterial compounds;antibacterial activity

1001-6880(2010)02-0274-04

2009-08-03 接受日期:2009-11-24

北京市自然科學(xué)基金 (6092015);國家自然科學(xué)基金(30871662)

＊通訊作者 Tel:86-10-62731199;E-mail:lgzhou@cau.edu.cn

Q939.92

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