宋應(yīng)華,陶 冶,羅小武

1重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,重慶 400067;2煤炭科學(xué)研究總院重慶研究院,重慶 400037

紅松樹皮中原花青素提取工藝研究

宋應(yīng)華＊,陶 冶2,羅小武1

1重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,重慶 400067;2煤炭科學(xué)研究總院重慶研究院,重慶 400037

采用溶劑回流提取的方法,以紅松樹皮中原花青素的提取率為考察指標(biāo),考察了提取溶劑種類、溶劑濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素對(duì)原花青素提取效果的影響。通過正交實(shí)驗(yàn),確定紅松樹皮中原花青素的最佳提取工藝條件為:提取溶劑 60%乙醇,提取溫度 50℃,料液比 1:7,提取時(shí)間 60 min。

紅松;原花青素;提取

原花青素 (PC)是廣泛存在于植物界中的聚多酚類物質(zhì),分布于植物的葉、花、果、皮內(nèi)[1-6]。松樹皮[7-9]提取物的主要成分是水溶性極高的 PC低聚物(OPC),同時(shí)還含有多種對(duì)人體有用的生物活性成分,具有顯著的清除自由基、抗氧化、保護(hù)心血管、抗腫瘤、防輻射及抗突變等多種生理功效,具有良好的開發(fā)前景。本文以我國浙江地區(qū)引進(jìn)種植的美國紅松樹皮為原料,采用溶劑回流提取法,對(duì)紅松樹皮中所含 PC進(jìn)行提取。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)方案,以 PC提取率為參考指標(biāo),對(duì)紅松樹皮 PC的溶劑回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)選,得出了紅松樹皮 PC溶劑回流提取工藝的最佳參數(shù)組合。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

原料:美國紅松樹皮由湖州恩貝希生物原料有限公司友情提供。

試劑:PC標(biāo)準(zhǔn)品,成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸硫酸鐵銨,均為分析純。

主要儀器:9FZ-35A型多用植物粉碎機(jī),四川國營簡陽機(jī)械廠;UV1102型紫外/可見分光光度計(jì),上海天美科學(xué)儀器有限公司;PL203型電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;HH型恒溫水浴,江蘇金壇市中大儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 松樹皮中 PC的提取方法

準(zhǔn)確稱取粉碎后的松樹皮 10 g于 250 mL圓底燒瓶中,在一定料液比、溶劑濃度和溫度條件下熱回流提取一定時(shí)間,取出過濾,減壓濃縮,將濃縮液定容,測(cè)定溶液中 PC含量。分別對(duì)溶劑濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以溶劑濃度、提取溫度、時(shí)間、料液比設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn) (見表 1),探討最佳提取工藝。為了提高試驗(yàn)精度,每號(hào)試驗(yàn)均重復(fù)兩次。

表 1 正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal exper iment

本文以所提取 PC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示提取率,即每 100 g松樹皮中經(jīng)提取得到的 PC量。

1.2.2 PC含量的測(cè)定——正丁醇-鹽酸法[10]

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取一定質(zhì)量 PC標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇溶解并定容,將其稀釋成不同濃度,分別取 1 mL不同濃度的 PC標(biāo)準(zhǔn)品溶液于 25 mL具塞試管中,分別加入 6 mL正丁醇-濃鹽酸 (v/v=95∶5)和 0.2 mL 2%鹽酸-硫酸鐵銨溶液,搖勻后,于 95℃水浴中加熱 40 min,然后用自來水迅速冷卻至室溫。以空白為對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)在 550 nm處測(cè)出其吸光度值,所取標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸光度數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理,回歸方程 Abs=0.0028c+0.0155,R2=0.9931。結(jié)果表明,PC在 22～110 ug/mL范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2 PC含量測(cè)定

取1 mL粗提物樣液進(jìn)行稀釋,定容。取上述溶液 1 mL于具塞試管中,分別加入 6 mL正丁醇-濃鹽酸(v/v=95:5)和 0.2 mL2%鹽酸-硫酸鐵銨溶液,搖勻后,于 95℃水浴中加熱 40 min,然后用自來水迅速冷卻至室溫。以 1 mL乙醇代替提取液重復(fù)上述操作,作為參比液,用紫外分光光度計(jì)在 550 nm處測(cè)出其吸光度值,并根據(jù)回歸方程計(jì)算待測(cè)液中的 PC含量,從而根據(jù)式(1)計(jì)算出 PC提取率。

式中,c為由回歸方程計(jì)算得到的濃度,ug/mL; m為稀釋倍數(shù);v為待測(cè)液體積,mL;w為稱取松樹皮質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

在熱回流提取條件下,選用相同濃度的乙醇、乙酸乙酯、丙酮和蒸餾水進(jìn)行提取,確定最佳提取溶劑,結(jié)果見圖 1。

圖 1 不同提取溶劑對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of extracting solvents on the yield of proanthocyanidins

由圖 1可知,采用蒸餾水提取的效果較差,而乙醇的效果最好。由于丙酮、乙酸乙酯等均有一定毒性,若去除不完全會(huì)對(duì)人體造成傷害,而水的提取效果太差,從安全、經(jīng)濟(jì)的角度考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為松樹皮 PC的最佳提取溶劑。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

考察了提取溶劑濃度、提取溫度、固液比和提取時(shí)間等因素對(duì) PC提取率的影響,以確定較佳工藝條件,結(jié)果如圖 2～5所示。

圖 2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

由圖 2可見,隨著乙醇濃度增加,PC提取率增大。當(dāng)乙醇濃度為 70%時(shí),PC提取率最高,如繼續(xù)增大乙醇濃度,則可能會(huì)使一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性較強(qiáng)成分溶出增加,導(dǎo)致 PC提取率有所下降,同時(shí),乙醇濃度過高,還會(huì)增加后續(xù)減壓濃縮回流操作時(shí)間,增加原料和操作成本,因此,以 70%乙醇對(duì)PC進(jìn)行提取較為適宜。

由圖 3可見,隨著溫度的升高,PC的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)溫度為 50℃時(shí),PC的提取率最高,如溫度進(jìn)一步升高,則將破壞活性成分,使PC的提取率下降。因此,確定50℃為松樹皮 PC提取的最佳溫度。

由圖 4可以看出,隨著提取溶劑用量的增加, PC提取率也會(huì)相應(yīng)地增加,當(dāng)料液比為 1:7(g/mL)時(shí),如溶劑用量繼續(xù)增加,則 PC的提取率增加并不明顯?？紤]到溶劑消耗,選用 1:7為適宜料液比。

圖 5 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of extracting time on the yield of proanthocyanidins

由圖 5可以看出,隨著提取時(shí)間的延長,PC提取率也不斷增大,當(dāng)提取時(shí)間超過 50 min后,松樹皮內(nèi)外組分濃度逐漸趨于平衡,PC提取率增加得并不明顯,同時(shí),提取時(shí)間的延長還會(huì)導(dǎo)致其受熱時(shí)間過長而變性,故選取 50 min為最佳提取時(shí)間。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

按 1.2.1所述 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平安排,考察松樹皮中原花素的提取效果。試驗(yàn)結(jié)果及分析見表 2和表3。

表 2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 The project and result of the orthogonal experiment

2.09 0.63 0.85 0.53 K21+K22+K2 R 6860.88 6768.38 6775.85 6767.47 G=∑yi=142.42 CT=G2/(9×2)=1126.86 K21+K22+K2 3 3 3×2 1143.48 1128.06 1129.31 1127.91 Sj=K21+K22+K2 3 3×2 -CT 16.62 1.20 2.45 1.05優(yōu)水平 A2 B1 C2 D3

表 3 方差分析表Table 3 The analysis of variance

由表 3可知,料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間等四個(gè)因素對(duì) PC的提取效果均有顯著影響,而料液比和提取溫度對(duì)其有著極顯著影響。由表 2分析可得,影響 PC提取效果的順序?yàn)?A>C >B>D,且 A2B1C2D3為最佳方案,即為正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的第 4號(hào)試驗(yàn),在該試驗(yàn)條件下,PC的提取率為 9.84%,均高于其它各組試驗(yàn)所得提取率,試驗(yàn)結(jié)果合理可行。

2.4 提取次數(shù)的確定

由圖 6可知,隨著提取次數(shù)增加,PC提取率也有所增加。但當(dāng)提取次數(shù)大于 3次時(shí),曲線趨勢(shì)已趨于平緩,即 PC提取率增加并不明顯。從溶劑用量和操作時(shí)間綜合考慮,確定提取次數(shù)為 3次。

圖 6 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.6 Effect of extracting times on the yield of proanthocyanidins

3 結(jié)論

通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),考慮各因素對(duì) PC提取效果的影響,紅松樹皮中 PC提取的最佳工藝條件為:提取溶劑 60%乙醇,提取溫度 50℃,料液比 1∶7,提取時(shí)間 60 min,提取 3次。

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Extracting Process of Proanthocyan idins fromPinus koraiensisBark

SONG Ying-hua1＊,TAO Ye2,LUO Xiao-wu11Institute of Environm ental and B iology Engineering,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China;2Chongqing Research Institute of Chinese Coal Research Institute,Chongqing 400037,China

The solvent reflux extraction process for proanthocyanidins fromPinus koraiensisBark was optimized by orthogonal design with L9(34)model.The extraction yield of proanthocyanidinswas regarded as the index of examination. The influence of the extraction solvent concentration,temperature,solid-liquid ratio and extracting time were investigated herein.Optimum extraction conditionswere determined as follows:extracting solventwas60%ethanol,extracting temperature was 50℃,solid-liquid ratio was 1∶7,extracting time was 60 min and extracting thrice.

Pinus koraiensis;proanthocyanidins;extract

1001-6880(2010)02-0339-04

2009-09-02 接受日期:2009-10-27

重慶市科委自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目 (CSTC, 2009BB7374);重慶工商大學(xué)青年科研基金項(xiàng)目(0752004)

＊通訊作者 Tel:023-62769785;E-mail:yhs wjyhs@126.com

R284.2;TS202.3

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