周松林,陳雙林,譚光宏,王 華,黃用豪,陳 凡

1海南醫(yī)學(xué)院熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,?？?571101;2南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210046

一株銀杏內(nèi)生真菌菌株的抑菌活性成分研究

周松林1＊,陳雙林2,譚光宏1,王 華1,黃用豪1,陳 凡1

1海南醫(yī)學(xué)院熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,?？?571101;2南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210046

從銀杏葉柄分離篩選到具抗菌活性的內(nèi)生真菌 Colletotrichum.SP NTB-2菌株,利用硅膠柱色譜、制備高效液相色譜等方法在其發(fā)酵產(chǎn)物中分離到抗枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌等具有廣譜抑菌活性的化合物,經(jīng)MS、NMR等波譜數(shù)據(jù)確認(rèn)該活性成分為芹菜素-8-C-葡萄糖苷(apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside),該化合物首次從真菌中分離得到。

內(nèi)生真菌;銀杏;芹菜素-8-C-葡萄糖苷

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

1100系列高壓液相色譜儀 (美國(guó) Agilent公司);制備色譜柱:Hichrom C18(10×250 mm,10 μm);Vario ELⅢ元素分析儀 (德國(guó)元素分析系統(tǒng)公司)分析;Burker AM 400核磁共振儀 (瑞士 Bruker公司);Autospec VG-3000質(zhì)譜儀 (美國(guó) Autospec公司);XT-4雙目顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公司)。

柱色譜用 200～300目硅膠 (Silica G),薄層層析用硅膠 G(均為青島海洋硅膠廠生產(chǎn)),其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌種

內(nèi)生真菌NTB-2為本實(shí)驗(yàn)室從江蘇省南通市的銀杏樹(shù)葉柄上通過(guò)組織分離法獲得的,通過(guò)顯微形態(tài)觀察,按 Sutton[5]的腔孢綱分類(lèi)系統(tǒng)鑒定為刺盤(pán)孢 Colletotrichumsp.。

大腸埃希氏菌 (Escherichia coliATCC 25922),金黃色葡萄球菌 (StaphylococcusaureusATCC 6538),枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilisATCC 9372),銅綠假單胞菌 (Pseudom onas aeruginosaATCC 27853 ),鼠傷寒沙門(mén)氏菌 (Sa lm onella typh im uriumCCG MC 11190),以上均購(gòu)自江蘇省疾病預(yù)防控制中心;不動(dòng)桿菌 (Acinetobacterspp.B667),洋蔥假單孢菌(Pseodom onas cepacia438),肺炎克雷伯氏菌 B673 (Klebsiella pneum oniae B667),檸 檬 酸 桿 菌(Citrobacter spp.38)、陰溝腸桿菌 (Enterobacter cloacae98-23),以上菌株由江蘇省省人民醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.1.3 培養(yǎng)基

快落山的太陽(yáng)光灑進(jìn)房間里，有點(diǎn)暗淡，又有點(diǎn)溫暖。齊海峰看著窗外想，周末要不要約她再去一次電影院呢？卻聽(tīng)她在外面扯著嗓子喊：“老齊，今晚包水餃好不好？”

馬鈴薯葡萄糖(PDA)液體(固體)培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,(瓊脂 18 g),水 1000 mL,自然 pH。LB(Luria Bertani)液體 (固體)培養(yǎng)基:蛋白胨 10g,NaCl 5 g,酵母粉 5 g,(瓊脂 16 g),用 1 mol/ L NaOH調(diào) pH 7.0,重蒸餾水定容至 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株NTB-2發(fā)酵

制備馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液,于500 mL三角瓶中裝液 250 mL。按 1/20接種量將 NTB-2孢子懸液(濃度為 107個(gè)/mL)接種到 PDA液體培養(yǎng)基中,26℃、150 r/min下培養(yǎng) 3～5 d后,再接種到 7 L的種子發(fā)酵罐 (裝液為5 L)中,26℃、150 r/min下培養(yǎng)5 d后,再放罐到 70 L的中式發(fā)酵罐 (裝液為 50 L)中,26℃、150 r/min下培養(yǎng) 7 d。期間不斷補(bǔ)充馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基,使發(fā)酵罐內(nèi)的總體積保持不變。

1.2.2 提取與分離

發(fā)酵結(jié)束后,用四層紗布濾過(guò),使菌體與發(fā)酵液分開(kāi),菌體用 70%的乙醇浸泡,浸泡 24 h后用濾紙濾過(guò),濾液減壓濃縮,再用 70%的乙醇浸泡菌體,重復(fù) 3次。發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取 3次,減壓濃縮萃取液,分別得濃縮物 8.3和 4.0 g。

合并菌體和發(fā)酵液的提取物共 12.3 g,上硅膠柱,用氯仿:甲醇 (100:0)和氯仿:甲醇 (90:10)梯度洗脫,100 mL收集組分,對(duì)各組分進(jìn)行薄層色譜分離,合并主產(chǎn)物相同的組分,得到粗產(chǎn)品化合物 1為148 mg。粗產(chǎn)品中的2 mg用去做抑菌的實(shí)驗(yàn),追蹤其活性成分的去向,剩余的然后在通過(guò)制備型HPLC進(jìn)行精制,得到化合物 1為 37.4 mg。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

本藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法 (K-B法)。將 10種供試菌株標(biāo)化后 15 min之內(nèi)接種于藥敏培養(yǎng)基,以無(wú)菌棉團(tuán)蘸取已制備好的細(xì)菌菌液,并在管壁上擠壓除去多余的菌液后,向一個(gè)方向均勻涂布接種于LB瓊脂平板表面,然后將平板每轉(zhuǎn)動(dòng) 60度涂布一次,共涂 3次,最后沿平板邊緣涂布一圈。蓋上平皿蓋,置室溫干燥 3～5 min,待平皿面稍干后用無(wú)菌鑷子將含藥紙片平放于含菌瓊脂平板表面,并輕壓使其緊貼在上面。平板經(jīng)室溫放置 15 min再倒置于 37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng) 16～18 h后閱讀結(jié)果,以上實(shí)驗(yàn)每處理重復(fù) 3次。

2 結(jié)果與討論

圖 1 化合物 1芹菜素-8-C-葡萄糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside isolated from Colletotrichumsp.NTB-2

2.1 化合物 1的結(jié)構(gòu)鑒定

芹菜素-8-C-葡萄糖苷 黃色粉末,mp.253～260℃。[α18°(c 2,吡啶)。EI-MSm/z(%): 433.4([M]+H),結(jié)合1H、13C NMR數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C21H20O10。UVnm:272,335,(MeOH +NaOAc)280,375,(MeOH +A ICI3)277,304, 346;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:6.26(1H,s, 3-H),6.64(1H,s,6-H),7.98(1H,d,J=8.4 Hz,2′-H),6.83(1H,d,J=8.8 Hz,3′-H),6.83(1H,d,J= 8.4 Hz,5′-H),7.98(1H,d,J=8.8 Hz,6′-H),13.16 (1H,s,5-OH),10.79(1H,s,7-OH),10.38(1H,s, 4′-OH),3.77(1H,d,J=7.8 Hz,1′′-H),3.61(1H, m,2′′-H),3.36(1H,m,3′′-H),3.61(1H,m,4′′-H),4.67(1H,m,5′′-H),3.24(2H,m,6′′-H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:163.9(C-2),98.2(C-3),182.1(C-4),160.5(C-5),104.6(C-6),162.6 (C-7),102.4(C-8),156.0(C-9),104.3(C-10), 121.6(C-1′),128.9(C-2′),115.8(C-3′),163.9(C-4′),115.8(C-5′),128.9(C-6′),73.4(C-1′′),70.8 (C-2′′),78.0(C-3′′),70.6(C-4′′),81.9(C-5′′), 61.3(C-6′′)。其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與芹菜素-8-C-葡萄糖苷 (apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside)[6-8]的數(shù)據(jù)一致。

2.2 抑菌結(jié)果

化合物 1對(duì)各種細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 1和圖 2～5,化合物 1對(duì)所有供試細(xì)菌都有明顯的抑菌作用,尤其是對(duì)枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、洋蔥假單胞菌作用明顯,其抑菌圈的大小都超過(guò)18mm,屬于高度敏感類(lèi)型;而對(duì)大腸桿菌、不動(dòng)桿菌、檸檬酸桿菌都有明顯的抑菌作用,屬于比較敏感類(lèi)型;屬于對(duì)所測(cè)菌高度敏感。

表 1 刺盤(pán)孢 Colletotrichumsp.NTB-2的產(chǎn)物對(duì)不同細(xì)菌的抑菌作用Table 1 Inhibitory effect ofColletotrichumsp.against different bacteria

圖 5 化合物 1對(duì)不動(dòng)桿菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of compound 1 againstCitrobacterspp

2.3 討論

銀杏所含的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜,其中黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯是銀杏葉發(fā)揮獨(dú)特藥理活性的有效成分。其黃酮類(lèi)苷元主要是:山奈酚、槲皮素、異鼠李素、楊梅醇及木樨素,另外還有少量芹菜素等,它們通常以糖苷形式存在[2,9]。芹菜素-8-C-葡萄糖苷,其天然的產(chǎn)物來(lái)源并不是很廣泛,曾在掌葉槭,黃瓜葉、夏至草等少數(shù)植物中分離得到,它主要作為一種抗氧化劑,可以清除體內(nèi)的自由基、超氧化基及抗衰老等作用[6-8,10]。從該菌株的液體培養(yǎng)基中分離到芹菜素-8-C-葡萄糖苷,這也為產(chǎn)芹菜素-8-C-葡萄糖苷提供一種新的來(lái)源。但我們看到產(chǎn)量還是不夠,需要進(jìn)一步的優(yōu)化其培養(yǎng)條件。雖然目前的文獻(xiàn)還沒(méi)有報(bào)道從銀杏葉或果實(shí)中分離得到芹菜素-8-C-葡萄糖苷。這也可能是因?yàn)閮?nèi)生真菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中與宿主植物建立了互惠共生關(guān)系,不僅參與了植物次生代謝產(chǎn)物的合成,而且有可能獨(dú)立承擔(dān)一些活性物質(zhì)的代謝合成,與宿主達(dá)到共贏互利的效果。植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的多樣性為我們發(fā)現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)新穎、活性專(zhuān)一的物質(zhì)提供了可能,值得我們進(jìn)一步的深人研究。

1 Strobel G,Daisy B.Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products.J M icrobiology And M olecularB iology,2003,67:491-502.

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Antibacterial Substances of Endophytic Fungus Isolated fromGinkgo biloba

ZHOU Song-lin1＊,CHEN Shuang-lin2,TAN Guang-hong1,WANG Hua1,HUANG Yong-hao1,CHEN Fan11Hainan Provincial Key Laboratory of TropicalM edicine,Hainan M edical Collge,Haikou 571101,China;2Life Science College of Nanjing Nor m alUniversity,Nanjing 210046,China

To study the antibacterial components from endophytic fungus strain,Colletotrichum.SP NTB-2 fromGinkgo biloba,silica gel column chromatography and pre-HPLC were used for the isolation and purification.A active compound was isolated from the fermentation broth of stains NTB-2 and identified as apigenin-8-C-beta-D-glucopyranoside on the basis of spectral data analysis.

endophytic fungus;Ginkgo biloba;apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside

1001-6880(2010)02-0193-04

2009-02-03 接受日期:2009-04-08

國(guó)家自然科學(xué)基金 (30560160);海南省自然科學(xué)基金(808157)

＊通訊作者 Tel:86-898-66893322;E-mail:zhousonglin106@163.com

R965;Q58

A