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利用蛋白質(zhì)微陣列篩選抗胸腺瘤優(yōu)勢(shì)抗原表位

2010-11-22 07:48:58王軼雄羅陳啟聞樹群
關(guān)鍵詞:表位肌無(wú)力多肽

方 序,王軼雄,羅陳啟,聞樹群,陳 敏

(1.浙江省微生物研究所,浙江 杭州 310012;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院,浙江 杭州 310009;3.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310036)

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)發(fā)病率近年在我國(guó)呈明顯上升趨勢(shì),重癥肌無(wú)力是一類自身免疫病,是由于機(jī)體免疫抑制性T細(xì)胞功能減弱,在自身反應(yīng)性Th細(xì)胞協(xié)同作用下,以神經(jīng)肌肉接頭處的N型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor, AChR)等分子作為抗原誘發(fā)自身抗體,通過抗體依賴的補(bǔ)體溶解作用參與對(duì)突觸后膜運(yùn)動(dòng)終板的破壞,導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳遞功能障礙,從而引發(fā)了一系列臨床癥狀[1-3].目前發(fā)現(xiàn)MG除了產(chǎn)生抗乙酰膽堿受體抗體外,還產(chǎn)生針對(duì)胸腺瘤相關(guān)抗原Titin等多種抗原成分的自身抗體.Titin是個(gè)大分子蛋白,是維持橫紋肌功能的關(guān)鍵組分.以前的自身抗體檢測(cè)集中在它的一個(gè)多肽片段(MGT30)上[4],除了MGT30,MG血清是否還存在Titin其他表位自身抗體呢?探明抗Titin抗體識(shí)別抗原表位,特別是優(yōu)勢(shì)抗原線性表位對(duì)進(jìn)一步的免疫干預(yù)有重要意義.但迄今為止尚缺少相應(yīng)文獻(xiàn)報(bào)道.在此通過設(shè)計(jì)了多個(gè)針對(duì)Titin蛋白胞外區(qū)的多肽序列,用蛋白質(zhì)微陣列的方法篩選抗Titin抗體識(shí)別的優(yōu)勢(shì)抗原表位,結(jié)果報(bào)告如下.

1 材料與方法

1.1 樣 本

共收集重癥肌無(wú)力患者新鮮血清84例,由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供.重癥肌無(wú)力診斷均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確認(rèn).所有樣本經(jīng)ELISA法檢測(cè)為抗AchR自身抗體陽(yáng)性.

1.2 多肽設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)偶聯(lián)

表1 合成多肽序列

根據(jù)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)9條針對(duì)Titin蛋白胞外區(qū)多肽序列見表1.多肽合成采用固相合成法(SPPS),合成后的多肽再采用琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來(lái)酸]-1-羧環(huán)己烷(SMCC)雙功能交聯(lián)劑在多肽巰基端與牛血清白蛋白(BSA)的氨基端偶聯(lián).

1.3 蛋白質(zhì)微陣列點(diǎn)制

用BCD法調(diào)整各蛋白濃度后,用蛋白點(diǎn)樣儀按8×12的方式將各多肽-BSA偶聯(lián)蛋白點(diǎn)樣于硝酸纖維膜(100 ng/點(diǎn)),每個(gè)多肽檢測(cè)重復(fù)6次,同時(shí)設(shè)立β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參照,待干燥后,用5%小牛血清封閉后,備用.

1.4 蛋白質(zhì)微陣列檢測(cè)

將待檢稀釋血清(1∶100,用5%小牛血清稀釋)與微陣列芯片反應(yīng)室溫2 h,用含0.5%Tween 20的0.01 mol/L,pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5次,再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫1 h,用含0.5%Tween 20的0.01 mol/L,pH7.4的PBS洗滌4次和無(wú)Tween 20的0.01 mol/L,pH7.4 PBS洗滌1次,最后加入CDP-star發(fā)光底物,曝光顯色1 min.將微陣列檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)換成TIFF圖片格式后,用Array2.0 version軟件分析,凡反應(yīng)信號(hào)與對(duì)照比較相差1.5倍以上者,為陽(yáng)性,否則為陰性.

1.5 微陣列結(jié)果驗(yàn)證

對(duì)微陣列檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果分別用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法進(jìn)行驗(yàn)證.將各多肽-BSA偶聯(lián)蛋白以1 μg/mL濃度包被微孔,過夜,次日取出,用含0.5%Tween 20的0.01 mol/L,pH7.4 PBS洗滌3次,用5%小牛血清封閉后,加入100 μL用5%小牛血清1∶100稀釋的待檢稀釋血清,37 ℃反應(yīng)2 h,洗滌5次,再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫1 h,洗滌5次,最后加入鄰苯二胺底物100 μL/孔,室溫避光顯色5~10 min.加入50 μL/孔硫酸終止反應(yīng),在490 nm處測(cè)各孔吸光度(A).凡A值≥對(duì)照1.5倍者,判為陽(yáng)性,否則為陰性.

2 結(jié) 果

2.1 重癥肌無(wú)力患者血清針對(duì)各多肽自身抗體陽(yáng)性例數(shù)

在84例MG血清中,51例抗多肽自身抗體陽(yáng)性,陽(yáng)性率為60.71%.經(jīng)蛋白質(zhì)微陣列方法篩選,結(jié)果表明,在設(shè)計(jì)的9條多肽抗原中,針對(duì)多肽P5、P6和P9的陽(yáng)性例數(shù)高于其他各多肽(見圖1).經(jīng)卡方檢驗(yàn),P<0.05.說明P5、P6和P9是優(yōu)勢(shì)識(shí)別表位.

2.2 P5、P6和P9識(shí)別表位交叉性鑒定

為鑒定P5、P6和P9識(shí)別表位有無(wú)交叉性,筆者分析了各樣本之間的共同陽(yáng)性情況.發(fā)現(xiàn)P5與P9多肽共同陽(yáng)性有8例(44.4%),而P5與P6多肽、P6與P9多肽間共同陽(yáng)性例數(shù)明顯低于P5與P9多肽間(見圖2),P<0.05.P5、P6和P9均陽(yáng)性的血清僅2例.結(jié)果表明,自身抗體識(shí)別的P5與P9多肽表位存在交叉性.

圖1 重癥肌無(wú)力患者血清針對(duì)各多肽自身抗體陽(yáng)性例數(shù)Fig. 1 Positive rate of autoantibodies to designed peptides of Titin in myasthenia gravis

圖2 P5、P6和P9識(shí)別表位交叉性鑒定Fig. 2 Validation of overlapped epitopes recognized by P5, P6, P9

2.3 ELISA驗(yàn)證試驗(yàn)

圖3 ELISA驗(yàn)證試驗(yàn)Fig. 3 Identification by ELISA assay

將微陣列檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果分別用ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果100%重復(fù);并且均能被多肽抗原阻斷,說明自身抗體與多肽結(jié)合呈特異性,蛋白質(zhì)微陣列方法篩選有效性好,如圖3所示.

3 討 論

重癥肌無(wú)力個(gè)體中,約85%的患者體內(nèi)存在針對(duì)AChR分子的自身抗體,致病性自身抗體的主要結(jié)合靶點(diǎn)位于AChR分子亞單位上的主要免疫原性區(qū)(main immunogenic region,MIR).依賴抗體的補(bǔ)體溶解作用是AChR分子破壞的主要原因;同時(shí)抗體介導(dǎo)的抗原調(diào)變作用也加速了AChR分子的內(nèi)化和溶酶體的降解作用,使得AChR分子的半衰期由7 d降至2 d,體內(nèi)神經(jīng)突觸后膜上功能性AChR分子的數(shù)量急劇減少.在單純眼外肌型患者體內(nèi),僅有50%的血清學(xué)陽(yáng)性率,而這些患者自身性抗體的主要結(jié)合靶點(diǎn)是胎兒型AChR分子.胎兒型AChR分子與成人型AChR分子最大的區(qū)別是AChR五聚體分子中的亞單位替代了t亞單位.胎兒型AChR分子主要分布于眼外肌,因此這類自身抗體導(dǎo)致了患者單純眼外肌受累,而無(wú)其它相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn).重癥肌無(wú)力患者血清中除乙酰膽堿受體抗體(AchRab)外,還可以檢測(cè)到其他自身抗體.如抗肌動(dòng)蛋白(actin)抗體、肌球蛋白(myosin)抗體、輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)抗體、肌聯(lián)蛋白(titin)抗體、AChR分子相關(guān)瞄定蛋白(mpsyn)抗體和肌肉特異性酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase Musk)抗體等.在這些自身抗體中,尤其是Titin在重癥肌無(wú)力伴胸腺瘤患者和重癥肌無(wú)力晚期中與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[5-7].

調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞在自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用.現(xiàn)有研究已證實(shí)腫瘤組織局部表現(xiàn)為Treg細(xì)胞免疫功能抑制,激活Treg細(xì)胞可導(dǎo)致動(dòng)物移植腫瘤消退;而在自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞免疫功能過度激活.因而抑制Treg細(xì)胞功能可能是自身免疫性疾病治療的新方法.篩選和鑒定抗原特異性Treg細(xì)胞是免疫治療的前提和基礎(chǔ).重癥肌無(wú)力中95%的患者外周血可檢測(cè)到抗Titin抗體,表明Titin在重癥肌無(wú)力患者中是優(yōu)勢(shì)識(shí)別抗原,提示重癥肌無(wú)力患者中存在Titin特異性Treg細(xì)胞,可從Titin蛋白分子中篩選和鑒定抗原特異性Treg細(xì)胞識(shí)別的抗原線性表位.Titin是個(gè)巨大的微絲狀蛋白質(zhì),在橫紋肌中單一的Titin跨越半個(gè)肌小節(jié).Titin從Z-盤狀轉(zhuǎn)變?yōu)镸-線狀在肌肉結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育過程中起重要作用.盡管Titin分子量巨大,但自身抗體識(shí)別的表位主要集中在主要免疫原性區(qū)(MIR),MGT30(30 kD).除了MGT30外是否還存在其他識(shí)別的表位呢?目前并不清楚.

微陣列和芯片診斷技術(shù)具有同時(shí)對(duì)幾十個(gè),乃至數(shù)萬(wàn)個(gè)基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,不僅大大減少了分別檢測(cè)的人力和物力,而且同時(shí)分析時(shí)克服了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)誤差[8-9].該研究采用生物信息學(xué)的手段,在微陣列檢測(cè)的基礎(chǔ)上,分別對(duì)單個(gè)表位抗體的診斷有效性進(jìn)行評(píng)估,通過對(duì)其有效性的不斷擬合,克服了單個(gè)檢測(cè)的不足.用該方法從中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)多肽表位在重癥肌無(wú)力患者中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá),但其是否為對(duì)抗原特異性Treg細(xì)胞識(shí)別表位需進(jìn)一步研究.

[1] Skeie G O, Aarli J A, Gilhus N E. Titin and ryanodine receptor antibodies in myasthenia gravis[J]. Acta Neurol Scand Suppl,2006,183:19-23.

[2] Bennett D L, Mills K R, Riordan-Eva P,etal. Anti-MuSK antibodies in a case of ocular myasthenia gravis[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry,2006,77(4):564-565.

[3] Mygland A, Tysnes O B, Matre R,etal. Anti-cardiac ryanodine receptor antibodies in thymoma-associated myasthenia gravis[J]. Autoimmunity,1994,17(4):327-331.

[4] Xu Tonghui, Jun Ding, Shi Yuliang,etal. Effects of myasthenia gravis patients’ sera with different autoantibodies on slow K+current at mouse motor nerve terminals[J]. Neurol Res,2003,25(1):58-62.

[5] Evoli A, Tonali P A, Padua L,etal. Clinical correlates with anti-MuSK antibodies in generalized seronegative myasthenia gravis[J]. Brain,2003,126(10):2304-2311.

[6] Yamamoto A M, Gajdos P, Eymard B,etal. Anti-Titin antibodies in myasthenia gravis: tight association with thymoma and heterogeneity of nonthymoma patients[J]. Arch Neurol,2001,58(6):869-870.

[7] Chen Xiangjun, Jian Qiao, Xiao Baoguo,etal. The significance of Titin antibodies in myasthenia gravis: correlation with thymoma and severity of myasthenia gravis[J]. J Neurol,2004,251(8):1006-1011.

[8] De Wildt R M, Mundy C R, Gorick B D,etal. Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions[J]. Nat Biotechnol,2000,18(9):989-994.

[9] Elshal M F, McCoy J P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA[J]. Methods,2006,38(4):317-323.

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