胡秀梅

(鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科, 鎮(zhèn)江 212000)

黃芩苷(baicalin)是唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis georgi)中提取的單體化合物,屬葡萄糖醛酸苷類,水解后產(chǎn)生黃芩素和葡萄糖醛酸。黃芩苷除了具有傳統(tǒng)意義上的清熱解毒、抑菌抗炎、利膽、降壓、利尿、抗變態(tài)反應(yīng)等生物活性外,近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗肺炎衣原體所致的動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、抗腫瘤和抗 HIV等多方面作用[1-4]。本文采用大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型考察了黃芩苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并初步探討了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 黃芩苷,南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供,純度＞90%;尼莫地平注射液,山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):0708006;水合氯醛,中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司,批號(hào):20070610;氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT),上海前進(jìn)化學(xué)試劑廠,批號(hào) 20060506;一氧化氮(NO)試劑盒,一氧化氮合酶(NOS)測(cè)定試劑盒,丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒,超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒,均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。GS-15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Beckman公司);Sartorius電子天平(德國(guó) Sartorius公司);T25basic勻漿機(jī)(德國(guó) IKA公司)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 清潔級(jí)雄性 SD大鼠72只,體重 240-310 g,購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(蘇)2008-0004。實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為6組,每組 12只,分別是假手術(shù)組,腦缺血再灌注模型組,黃芩苷組[15,45,135 mg/(kg· d)],尼莫地平組[5 mg/(kg· d)]。各組動(dòng)物連續(xù)尾靜脈注射給藥 3 d后,并于缺血 3 h再灌注即刻重復(fù)給藥一次,假手術(shù)組和模型組于相同時(shí)間給予相應(yīng)體積的生理鹽水,分別于再灌注 30 min,4 h,24 h后檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

以長(zhǎng)50 mm、直徑 0.24 mm、頂端燙制成光滑球狀的尼龍線作為栓子,采用改進(jìn)的Longa的方法[5]制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型。缺血 3 h后再灌注,再灌注時(shí)輕拉尼龍線,使尼龍線拔出顱外。假手術(shù)組只進(jìn)行麻醉和血管分離術(shù),不結(jié)扎血管及導(dǎo)入尼龍線。以上過(guò)程均在室溫恒定(24-25℃)情況下進(jìn)行,以利于評(píng)價(jià)腦缺血情況。

1.3 大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血行為評(píng)分法 參考 Bederson等[6]的方法,分別在動(dòng)物缺血再灌注 4 h和24 h時(shí)對(duì)各組動(dòng)物的行為缺陷進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分,提尾懸空時(shí),動(dòng)物的兩前肢均伸向地板方向且無(wú)其他行為缺陷;1分,提尾懸空時(shí),動(dòng)物的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲、肩內(nèi)旋、肘外展、緊貼胸壁;2分,將動(dòng)物置于光滑平面上,推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)阻力降低;3分,動(dòng)物自由行走時(shí),向手術(shù)對(duì)側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈。

1.4 NBT染色測(cè)量腦梗死率 大鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦,去除嗅球、小腦和低位腦干,取左側(cè)(即缺血區(qū))大腦半球沿冠狀面切成 5片,進(jìn)行NBT染色,置 37℃溫育 15 min后,正常組織呈藍(lán)色,梗死組織呈白色。小心挖取并稱重未染色的梗死腦組織,并計(jì)算梗死腦組織質(zhì)量占對(duì)側(cè)大腦質(zhì)量的百分比,作為腦梗死率[7]。

1.5 腦含水量的測(cè)定 大鼠腦缺血再灌注 24 h后處死,取出大腦稱濕重后將腦組織置于 115℃電熱干燥箱中烘至恒重,稱干重,按下列公式計(jì)算腦含水量及腦指數(shù)[8]:含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%;腦指數(shù)=(腦濕重 /體重)×100。

1.6 腦組織中 NO、NOS、MDA、SOD含量測(cè)定 腦組織勻漿的制備[9]:大鼠于缺血再灌注 30 min后斷頭快速取腦,將左側(cè)腦組織用濾紙擦去表面殘血,用分析天平稱取 0.5 g,按 1∶9加入生理鹽水,用玻璃勻漿器研磨,制成 10%腦組織勻漿,4℃ 4 000 r/min離心 10 min,取上清液,-20℃保存待測(cè)生化指標(biāo)。

采用硝酸還原酶法測(cè)定腦組織中 NO含量,采用 NOS檢測(cè)試劑盒測(cè)定 NOS的活性,采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定腦組織 MDA含量,SOD活力檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法,以上所有操作均按試劑盒操作程序進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠的行為學(xué)評(píng)分的影響 腦缺血再灌注 4 h和24 h后,所有試驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了不同程度的行為障礙,模型組行為學(xué)評(píng)分分別是 2.75±0.41和2.08±0.52。其中 4 h后,黃芩苷各劑量組大鼠的行為學(xué)評(píng)分與模型組相近,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在 24 h后,黃芩苷各劑量組動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)分均呈下降趨勢(shì),中、高劑量組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死率的影響大鼠缺血再灌注后腦組織出現(xiàn)明顯梗死,梗死率達(dá)(22.25±6.42)%;黃芩苷低、中、高各劑量組大鼠腦梗死率出現(xiàn)了明顯降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響 假手術(shù)組大鼠腦含水量和腦指數(shù)分別為(72.58±9.61)%和0.42±0.13,腦缺血再灌注模型組大鼠腦含水量和腦指數(shù)分別為(79.54±8.95)%和0.51±0.16,腦部出現(xiàn)水腫特征,與假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。黃芩苷中、高劑量組對(duì)于水腫特征具有明顯改善作用,與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率、腦含水量和腦指數(shù)的影響 (±s,n=12)Tab 1 Effect of baicalin on behavior,cerebral infarction,water content of brain tissues and cerebral index in ischemiareperfusion rats (±s,n=12)

表1 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率、腦含水量和腦指數(shù)的影響 (±s,n=12)Tab 1 Effect of baicalin on behavior,cerebral infarction,water content of brain tissues and cerebral index in ischemiareperfusion rats (±s,n=12)

與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與假手術(shù)組比較,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

?

2.4 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織 NO、NOS、MDA、SOD的影響 大鼠腦缺血 3 h再灌注 30 min后引起腦組織 NO和NOS含量的升高,黃芩苷各個(gè)劑量組均能顯著降低腦組織內(nèi) NO的含量(P＜0.05,P＜0.01),NOS活性亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì),黃芩苷高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。大鼠腦缺血再灌注 30 min后MDA含量明顯升高,SOD含量明顯下降,黃芩苷能降低 MDA的含量,并升高 SOD的含量,中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織 NO、NOS、MDA、SOD的影響 (±s,n=12)Tab 2 Effect of baicalin on NO,NOS,MDA,SOD contents of brain tissues in ischemia-reperfusion rats (±s,n=12)

表2 黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織 NO、NOS、MDA、SOD的影響 (±s,n=12)Tab 2 Effect of baicalin on NO,NOS,MDA,SOD contents of brain tissues in ischemia-reperfusion rats (±s,n=12)

與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與假手術(shù)組比較,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

45 mg/(kg· d) 22.46±5.82** 3.26±1.08 42.32±7.88* 379.40±64.55*135 mg/(kg· d) 17.76±4.91** 3.05±0.83* 33.79±6.47** 449.82±80.76**

3 討論

缺血性腦血管疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率均較高,一般以局灶性腦缺血為主,其中大腦中動(dòng)脈栓塞造成的腦梗死最為多見(jiàn)。溶栓療法可使血管再通恢復(fù)血供,但同時(shí)亦可導(dǎo)致更為嚴(yán)重的腦缺血再灌注損傷,尋找具有能減輕腦缺血再灌注損傷的藥物意義重大。黃芩苷是中藥黃芩的有效成分之一,相對(duì)分子質(zhì)量 446,可通過(guò)血腦屏障。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)行為學(xué)具有明顯的改善作用,還能降低腦缺血再灌注大鼠的腦梗死率和腦含水量,對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用,并具有劑量效應(yīng)關(guān)系。尼莫地平因其對(duì)腦缺血再灌注損傷具有確切的保護(hù)作用,在實(shí)驗(yàn)研究中常被用來(lái)做陽(yáng)性對(duì)照藥物,本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),尼莫地平5 mg/(kg·d)的劑量能顯著改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,降低腦梗死率和腦含水量,與黃芩苷中高劑量組作用相似。

缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中,自由基的作用和細(xì)胞內(nèi)鈣超載是其發(fā)病學(xué)的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。再灌注損傷后機(jī)體通過(guò)多種途徑產(chǎn)生的自由基對(duì)細(xì)胞的各種成分(膜磷脂、蛋白、核酸)造成損傷。姜德華等[10]研究發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血 30 min NO含量和NOS活性即顯著升高,缺血 3 h兩者下降;再灌注 30 min NO和NOS又再次升高,說(shuō)明 NO和NOS參與了腦缺血再灌注的發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在腦缺血 3 h再灌注 30 min后腦組織NO和NOS的含量顯著升高,黃芩苷能明顯降低腦組織內(nèi) NO的含量和NOS的活性,從而減輕 NO的神經(jīng)細(xì)胞毒性。同時(shí),黃芩苷能降低缺血再灌注大鼠腦組織 MDA的含量,并增加 SOD的活性,從而抑制自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化作用,減輕自由基對(duì)腦組織的損傷,發(fā)揮一定的腦保護(hù)作用。黃芩苷的腦保護(hù)作用可能與其在腦缺血再灌注早期具有抗氧化作用有關(guān),但其他作用途徑和詳盡作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] 吳偉,黃衍壽,劉煜德,等.肺炎衣原體對(duì)動(dòng)脈硬化斑塊面積的影響及黃芩苷的干預(yù)作用[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(4):322-325.

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