張貴鋒，江世平，王 立，唐少蘭，梁偉斌

(廣東省新興中藥學(xué)校，廣東 新興527400)

哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥反應(yīng)［1］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素、穴位埋線等療法對其均有較好療效，但是哮喘的發(fā)病和療效機(jī)制十分復(fù)雜，諸多因素參與其中，其發(fā)生機(jī)制、療效機(jī)制等迄今仍未完全明了。本研究運(yùn)用西藥地塞米松、中醫(yī)穴位埋線兩種療法干預(yù)卵白蛋白致敏的哮喘豚鼠模型，觀察豚鼠氣管組織中相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)情況，探索哮喘的發(fā)病機(jī)制，西藥和穴位埋線治療哮喘的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康FMMU 白化豚鼠48 只，普通級，雌雄各半，體質(zhì)量300～400 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，動物質(zhì)量合格證號:0029336。實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證明編號:0023200。

1.2 主要試劑與儀器

卵白蛋白(OVA，GradeⅡ)，美國Sigma 公司產(chǎn)品;“4－0”號醫(yī)用羊腸線，山東圣美醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品，批號2008100911;水溶性封片劑，廣州晶美公司產(chǎn)品，批號20080613;ET-1 羊抗兔、TGF-β1羊抗兔、MMP-9 羊抗兔、NF-κB 兔抗鼠、ICAM-1 兔抗人免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司提供，批號BA0421－25。WH－2000 型超聲霧化噴霧器，粵華醫(yī)療器械廠有限公司產(chǎn)品;Sartorius 電子天平BS110S，德國賽多利斯(sartorius)公司產(chǎn)品;Leica DMRA 顯微鏡、DC 200 掃描儀、Leica Qwin 550圖像分析系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡(Olympus BX50 生物組織顯微鏡)、Leica 2245 型半自動石蠟切片機(jī)、Leica EG1140 型石蠟包埋機(jī)、Leica TP1020 型生物組織脫水機(jī)、Leica RM2255 型全自動石蠟切片機(jī)及Leica 5010 型石蠟切片染色機(jī)，均為德國徠卡(Leica)儀器有限公司產(chǎn)品;700 型恒溫水浴箱，東西儀(北京)科技有限公司產(chǎn)品;攤烘片機(jī)，ZMN 200 型，常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組

將豚鼠48 只隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、地塞米松組及穴位埋線組，每組12 只。每組雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.4 模型的建立

參照文獻(xiàn)［2］建立哮喘模型。除正常對照組外，其余各組豚鼠于實(shí)驗(yàn)第1 天和第8 天分別腹腔注射10%卵白蛋白(OVA)和氫氧化鋁溶液1 mL 致敏;實(shí)驗(yàn)第15 天起開始霧化吸入1% OVA 溶液20 min 誘喘，霧化流量為3 mL/min，1d 1 次，連續(xù)2 周，至豚鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸深快、點(diǎn)頭運(yùn)動及喘息等哮喘癥狀。正常對照組用注射用水代替卵白蛋白液進(jìn)行注射和霧化吸入。

1.5 給藥方法

正常對照組:不做任何干預(yù)。模型對照組:實(shí)驗(yàn)第15 天起腹腔注射注射用水0.020 mg/g，1 d 1 次，連續(xù)2 周。地塞米松組:于實(shí)驗(yàn)第15 天起腹腔注射地塞米松0.001 5 mg/g，1 d 1 次，連續(xù)2 周。穴位埋線組:哮喘癥狀出現(xiàn)后第2 天埋線，每周1 次。參照文獻(xiàn)［3］選擇豚鼠定喘穴、肺俞穴、足三里穴及豐隆穴。具體操作方法:先將羊腸線置于無菌彎盤中，倒入生理鹽水沖洗，并剪成0.2～0.4 cm 小段若干;將腸線從無菌8 號注射針針尖穿入，再將預(yù)先剪去針尖的毫針從注射針針尾部穿入，羊腸線穿入注射針后保持水平，以免滑落。埋線時無菌操作，持針刺入穴位，到達(dá)預(yù)定深度后，先稍稍退針，然后一手固定注射針頭，令一手拇指抵住毫針針尾作注射狀，緩慢將羊腸線擠入穴內(nèi)，感覺注射針內(nèi)有突然空虛感時即可出針，并確認(rèn)腸線已埋入皮下或肌層，無菌棉簽按壓針孔處止血。每穴1 針。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 取 材

在末次激發(fā)后2～4 h 處死豚鼠，迅速打開胸腔，暴露肺及心臟，常規(guī)取右中下肺一個橫切面，包括肺門。所取組織經(jīng)100 mL/L 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋和切片(厚4 μm)待測。切片分為5 組備用。

1.6.2 內(nèi)皮素－1(ET-1)的檢測

采用免疫組化法檢測。主要步驟按照試劑盒說明書依次進(jìn)行操作:①備用切片經(jīng)純二甲苯脫臘兩次，每次6 min;②梯度乙醇脫二甲苯各2 min;③自來水漂洗、PBS 漂洗各3 次，每次2 min;④加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下作用10 min;⑤切片放入己沸騰的檸檬酸修復(fù)液中，繼續(xù)加熱至溶液冒小氣泡但不沸騰為度，保持10 min;⑥停止加熱，冷卻至室溫約25 min，流水沖洗，PBS 液洗兩次，擦干切片組織周圍表面水分劃隔離圈，加入5%BSA封閉液，室溫下作用20 min;⑦吸去血清，不洗直接滴加入相應(yīng)的濃度1 ∶100 稀釋后第一抗體兔抗(ET-1)100 μL/片，每組均取1 張切片滴加PBS 做陰性對照，37 ℃恒溫箱內(nèi)1 h;⑧PBS 沖洗，3 min ×3 次，滴加ET-1 羊抗兔生物素化二抗，37 ℃恒溫箱內(nèi)20 min;⑨PBS 沖洗，3 min ×3 次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親合素，37 ℃恒溫箱內(nèi)20 min;⑩PBS洗后滴加入DAB 顯色液，顯色3～5 min;○1 蘇木素淺復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、分析結(jié)果。

1.6.3 轉(zhuǎn)化生長因子－β1 (TGF-β1)的檢測

采用免疫組化法檢測。主要步驟同ET-1 檢測，按照試劑盒說明書依次進(jìn)行操作，不同的是選用TGF-β1 羊抗兔免疫組化試劑盒。

1.6.4 基質(zhì)金屬蛋白酶－9 (MMP-9)的檢測

采用免疫組化法檢測。主要步驟同ET-1 檢測，按照試劑盒說明書依次進(jìn)行操作，不同的是選用MMP-9 羊抗兔免疫組化試劑盒。

1.6.5 核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的檢測

采用免疫組化法檢測。主要步驟同ET-1 檢測，按照試劑盒說明書依次進(jìn)行操作，不同的是選用NF-κB 兔抗鼠免疫組化試劑盒。

1.6.6 細(xì)胞間黏附分子－1(ICAM-1)的檢測

采用免疫組化法檢測。主要步驟同ET-1 檢測，按照試劑盒說明書依次進(jìn)行操作，不同的是選用ICAM-1 兔抗人免疫組化試劑盒。

1.6.7 各指標(biāo)檢測結(jié)果處理

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用染色指數(shù)計數(shù)法判斷［4］。每張切片在10 ×20 倍光鏡下隨機(jī)觀察每1 組動物同一部位切片，選擇5 個不重復(fù)視野進(jìn)行觀察，并聯(lián)接圖像分析系統(tǒng)，分別測出每張切片內(nèi)支氣管肺組織相關(guān)細(xì)胞因子的染色百分比，即染色面積。陽性物質(zhì)在胞漿(膜上)內(nèi)呈棕黃色細(xì)顆粒狀，細(xì)胞核為淺藍(lán)色，陰性對照為陰性。染色強(qiáng)度按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱分為無色、淡黃、黃色、棕黃色，分別計為0，1，2，3 分。染色指數(shù)=染色面積×染色強(qiáng)度。如在同一病變中存在不同評分標(biāo)準(zhǔn)的視野，則取最大值和最小值的平均值作為其染色指數(shù)評分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

模型對照組支氣管肺組織ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞指數(shù)均顯著高于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);穴位埋線組和地塞米松組支氣管肺組織ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞指數(shù)均低于模型對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);穴位埋線組支氣管肺組織ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞指數(shù)與地塞米松組對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組豚鼠支氣管肺組織中蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞染色指數(shù)比較 ±s

表1 各組豚鼠支氣管肺組織中蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞染色指數(shù)比較 ±s

注:與正常對照組對比，＊＊＊ P＜0.01;與模型對照組對比，## P＜0.05;與地塞米松組對比，△P ＞0.05。

MMP-9 NF-kB ICAM-1正常對照組 12 13.84 ±3.67 15.12 ±3.26 11.71 ±2.98 13.12 ±3組 別 動物數(shù) ET-1 TGF-β1.03 12.10 ±2.91模型對照組 12 32.11 ±5.01＊＊＊ 35.08 ±5.19＊＊＊ 28.64 ±4.76＊＊＊ 28.14 ±4.72＊＊＊ 27.22 ±6.03＊＊＊地塞米松組 12 20.45 ±3.88＊＊＊## 23.27 ±4.02＊＊＊## 17.52 ±4.03＊＊＊## 20.10 ±4.42＊＊＊## 19.67 ±4.50＊＊＊##穴位埋線組 12 23.34 ±4.25＊＊＊##△ 25.19 ±4.13＊＊＊##△ 20.04 ±3.85＊＊＊##△ 21.33 ±3.97＊＊＊##△ 21.17 ±4.28＊＊＊##△

3 討 論

ET-1 是迄今所知最強(qiáng)的氣管、支氣管平滑肌收縮劑，其收縮效應(yīng)與濃度呈劑量依賴關(guān)系［5］。目前普遍認(rèn)為ET-1 會與多種哮喘相關(guān)炎性介質(zhì)相互作用而加重機(jī)體的缺血、缺氧狀態(tài)，從而加重哮喘癥狀，增加肺循環(huán)阻力，影響哮喘患者小氣道功能［6］。TGF-β1 刺激氣道平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、杯狀細(xì)胞增生肥大，促進(jìn)膠原Ⅰ、Ⅳ型和纖連蛋白合成。在哮喘患者的氣道中，平滑肌細(xì)胞分泌大量的TGF-β1，而TGF-β1 反過來又促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生肥大，增加膠原和纖連蛋白合成，并促進(jìn)其在細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致管腔狹窄和不可逆的肺功能改變［7－9］。MMP-9 通過降解上皮基膜及內(nèi)皮的IV 型膠原而破壞上皮基膜及內(nèi)皮，從而使炎癥細(xì)胞穿透破裂的內(nèi)皮層到達(dá)炎癥部位，促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，通過參與炎癥細(xì)胞的跨膜遷移在氣道炎癥及氣道重塑中發(fā)揮重要作用［10－12］。NF-κB 是參與炎癥反應(yīng)中的一個重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，調(diào)節(jié)許多炎癥基因的表達(dá)，在誘導(dǎo)肺的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［13］。ICAM-1 參與并介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互黏附，是炎癥形成的基礎(chǔ)［14］。研究表明，ICAM-1 對于哮喘氣道嗜酸粒細(xì)胞氣道的浸潤以及氣道高反應(yīng)性的形成具有重要作用［15］。

本研究結(jié)果表明，模型對照組、地塞米松組、穴位埋線組豚鼠氣管組織中ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 陽性細(xì)胞指數(shù)均顯著高于正常對照組，提示上述細(xì)胞因子與哮喘氣道炎癥和氣道重構(gòu)有內(nèi)在聯(lián)系，支氣管肺組織ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 水平的升高可能是哮喘氣道重構(gòu)發(fā)生的病理機(jī)制之一。

地塞米松等糖皮質(zhì)激素類藥物是目前臨床治療中最為有效的藥物，是治療急性嚴(yán)重哮喘、慢性哮喘的首選藥物。目前主要應(yīng)用吸入型糖皮質(zhì)激素，其起效快，局部濃度高，效果好，能改善不同程度的氣流阻塞、氣道高反應(yīng)性以及因哮喘反復(fù)發(fā)作而減退的肺功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松組豚鼠豚鼠氣管組織中ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 陽性細(xì)胞指數(shù)低于模型對照組，提示臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物治療哮喘的效果可能通過調(diào)控ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮作用。穴位埋線組豚鼠氣管組織中的ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 陽性細(xì)胞指數(shù)低于模型對照組，與地塞米松組對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果提示，穴位埋線對于哮喘的干預(yù)效果和地塞米松無差別，這在一定程度上證明了臨床運(yùn)用穴位埋線治療哮喘病的科學(xué)性，穴位埋線可能是通過調(diào)控ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮治療哮喘的療效。此外，穴位埋線療法不良反應(yīng)很少，是一種公認(rèn)的綠色療法。因此，在哮喘等疾病的治療上，傳統(tǒng)的中醫(yī)藥及針灸療法有一定的優(yōu)勢。

綜上所述，卵蛋白致敏哮喘豚鼠氣管組織中的ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等細(xì)胞因子存在失衡，穴位埋線療法治療哮喘可能是通過對上述細(xì)胞因子的調(diào)控而發(fā)揮效應(yīng)。本研究中埋線組和地塞米松組豚鼠氣管組織中相關(guān)細(xì)胞因子的改變對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量偏少有關(guān)。ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等細(xì)胞因子在哮喘病中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］王吉耀.內(nèi)科學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:49.

［2］陳湘琦，林挺巖. 選擇卵蛋白致敏豚鼠建立哮喘模型實(shí)驗(yàn)研究［J］.福建醫(yī)藥雜志，2005，27(1):101－103.

［3］郭義.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2008:410.

［4］張鳴號，彭亮，曹軍.顯微圖像分析法與人工計數(shù)法在免疫組化結(jié)果判讀中的應(yīng)用［J］. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，31(2):261－262.

［5］Mc Whinnie R，Pechkovsky DV，Zhou D，et al. Endothelin－1，induces hypetrophy and inhibits apoptosis in human airway smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292:1 278－1 286.

［6］王樂強(qiáng)，孫開字，譚薇. 內(nèi)皮素－1 與支氣管哮喘小氣道的關(guān)系［J］.臨床心身疾病雜志，2007，13(3):195－196.

［7］Na kao A. Is TGF-β1 the key to suppression of human asthma［J］.Trends Immunol，2001，22:115－118.

［8］徐毛冶，黃茂，王凱平，等.外周血轉(zhuǎn)化生長因子－β1 在支氣管哮喘中的作用［J］. 江蘇醫(yī)藥雜志，2004，30(9):704.

［9］付明舉，賴火特，唐純志，等. 穴位埋線對哮喘豚鼠氣道病理形態(tài)學(xué)改變和TGF-β1 的影響［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，27(4):29－34.

［10］許小揚(yáng)，林楠. 哮喘豚鼠MMP-9、TMP-1 的表達(dá)及與氣道炎癥重塑的關(guān)系［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，1(4):11.

［11］寧方玉，王曉芝.MMP-9 與支氣管哮喘［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，2(30):118.

［12］付明舉，賴火特，唐純志，等.穴位埋線對哮喘豚鼠支氣管肺組織MMP-9 的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(8):1 648－1 650.

［13］Zhou L F，Zhu Y，Cui XF，et al. Arsenic trioxide，a potent inhibitor of NF-kappaB，abrogates allergen-induced airway hyperresponsiveness and inflammation［J］. Respir Res，2006，7:146.

［14］Furusho S，Myou S，F(xiàn)ujimura M，et al. Role of intercellular adhesion molecule-1 in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma［J］. Clin Exp Allergy，2006，36(10):1 294－1 302.

［15］崔瑾，陳盼碧，楊孝芳，等. 簡易穴位埋線對哮喘大鼠ICAM-1 和NF-κB 表達(dá)及氣道炎癥的影響［J］. 中國針灸，2010，30(2):141－145.