王仲兵，古少鵬

（1.山西省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山西太原 030000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

雞球蟲病是由艾美耳球蟲中的一種或幾種寄生于雞腸道黏膜上皮引起的一種寄生性原蟲病[1]，世界各地普遍發(fā)生，是目前養(yǎng)禽業(yè)中危害最大的一種寄生蟲病[2]。目前認(rèn)為主要有7種禽艾美耳球蟲，即堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲、布什艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲[3]。大多數(shù)球蟲均具有一定的致病性，這使球蟲診斷問題復(fù)雜化，而且7種球蟲在卵囊形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小、腸道病變、寄生部位、最短孢子化時(shí)間、最短潛伏期等均具有自身特征，它們之間沒有交叉免疫原性，同一宿主可以同時(shí)感染幾種球蟲。因此，球蟲卵囊的分離技術(shù)是鑒定球蟲的種類和建立球蟲的純種體系，調(diào)查某地區(qū)內(nèi)球蟲種類和獲得球蟲的純種體系的重要手段[4]，對(duì)進(jìn)一步研究球蟲的致病性、藥物效應(yīng)、產(chǎn)生的耐藥性和禽體對(duì)球蟲的免疫性，以及對(duì)抗球蟲藥的開發(fā)和球蟲疫苗研制有重要意義[5]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)蟲株

從太谷縣某雞場(chǎng)采集糞便，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查確定含有球蟲卵囊，用飽和鹽水漂浮法分離出球蟲卵囊，作本試驗(yàn)使用蟲株。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)自太谷縣韓村種雞場(chǎng)海蘭白公雛，在無球蟲環(huán)境中飼養(yǎng)，飼料經(jīng)高壓后使用，飲水為清潔涼開水。經(jīng)糞便檢查，確認(rèn)無球蟲感染后作為單卵囊分離試驗(yàn)用動(dòng)物。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：飽和食鹽水、重硌酸鉀溶液、等滲溶液、氨水；

主要儀器：電子顯微鏡、離心機(jī)、溫箱等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 野毒株的采集及擴(kuò)增

采集含有球蟲卵囊的雞的糞便，以飽和鹽水漂浮法分離球蟲，經(jīng)增殖獲得大量混合球蟲卵囊，置2.5%重硌酸鉀溶液保存。

2.2 單卵囊分離試驗(yàn)

制備1%瓊脂，溶解后澆在培養(yǎng)皿上，厚約1.5 mm，凝固后切成每邊為0.4 cm的小方塊，移至載玻片上。將保存的混合卵囊用等滲溶液稀釋至顯微鏡下觀察每小滴含1~2個(gè)球蟲卵囊為止。用毛細(xì)滴管將一小滴卵囊液滴于瓊脂塊上，顯微鏡下觀察，當(dāng)確定液滴內(nèi)只有一個(gè)孢子化的球蟲卵囊時(shí)，將一小塊保鮮膜覆蓋于液滴上，經(jīng)口喂雛雞，并滴入數(shù)滴涼開水，促進(jìn)其吞咽。

將感染單個(gè)卵囊的雞于已消毒環(huán)境中隔離飼養(yǎng)，從感染后96 h逐只檢查糞便，保存含有球蟲的糞便，感染一周后剖殺，取腸內(nèi)容物鏡檢，發(fā)現(xiàn)卵囊的即為單卵囊后代，收集保存盲腸和糞便中的卵囊。

2.3 卵囊擴(kuò)增

將單卵囊分離試驗(yàn)盲腸收集所得的卵囊接種10只11日齡無球蟲小雞，一周后剖殺，收集球蟲，獲得大量純種卵囊。

2.4 蟲種鑒定

將上步所得卵囊感染的雛雞，每日觀察雞的精神狀態(tài)、食欲和最早發(fā)現(xiàn)血便的時(shí)間，記錄潛隱期，剖殺后觀察整條腸道，記錄主要病變部位。對(duì)收集的純種球蟲卵囊在帶有測(cè)微尺的顯微鏡下觀測(cè)其形態(tài)結(jié)構(gòu)，測(cè)量其長(zhǎng)徑、寬經(jīng)、大小，計(jì)算該株卵囊的形狀指數(shù)，并將收集到的純種卵囊保存于重硌酸鉀溶液中，置28℃溫箱培養(yǎng)，記錄其最短孢子化時(shí)間，待其孢子化后，在顯微鏡下觀測(cè)孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小，根據(jù)上述各項(xiàng)綜合指標(biāo)確定蟲種。

2.4 蟲種致病性觀察

將11日齡無球蟲雞，分為7個(gè)組，每組9只。分別以1×103個(gè)／只、5×103個(gè)／只、1×104個(gè)／只、2×104個(gè)／只、5×104個(gè)／只、10×104個(gè)／只攻毒，另一組為對(duì)照組。接種后每日觀測(cè)雞的精神狀態(tài)、飲食欲和血便情況，記錄并剖檢死亡雞。一周后剖殺全部試驗(yàn)雞，記錄攻毒前體重、剖殺前體重、死亡率、盲腸病變記分和O.P.G值，計(jì)算體增重、相對(duì)增重率、抗球蟲指數(shù)（ACI）值和半數(shù)感染量（ID50）、半數(shù)致死量（LD50）。

2.4.1 盲腸病變記分參照田角清[6]標(biāo)準(zhǔn)

0：未見病變；

1：盲腸壁有極少量散在出血斑，腸壁增厚，內(nèi)容物正常；

2：盲腸內(nèi)有少量血液，腸壁增厚，可見多處出血斑;

3：盲腸內(nèi)有多量血液，腸壁肥厚，有明顯的盲腸變形和萎縮；

4：盲腸顯著萎縮，病變達(dá)直腸部，腸壁極度肥厚，盲腸內(nèi)有盲腸芯。

若兩側(cè)病變不一致，以病變嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn)。

2.4.2 ACI值的計(jì)算

ACI=（存活率+相對(duì)增重率）-（病變記分+卵囊值）[6]

卵囊值：

O.P.G值為0～0.1，卵囊值為0；

O.P.G值為0.1～1，卵囊值為1；

O.P.G值為2～5，卵囊值為10；

O.P.G值為6～10，卵囊值為20；

O.P.G值≥11，卵囊值為40。

O.P.G值為每克糞便中的卵囊數(shù)，以×106為單位。

2.4.3 ID50（半數(shù)感染量）根據(jù)血便百分率來計(jì)算；LD50（半數(shù)致死量）根據(jù)死亡率來計(jì)算[7]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 蟲種鑒定結(jié)果

感染單卵囊后代的雛雞，感染初期，試驗(yàn)雞精神、飲食欲無明顯的異常。感染后120 h，感染雞表現(xiàn)為飲食欲減少，羽毛逆立，糞便變稀，個(gè)別雞開始拉鮮紅色糞便；135 h開始，每隔兩小時(shí)鏡檢一次糞便，到141 h時(shí)，第一次從糞便中檢出球蟲卵囊，可見其最短潛隱期為141 h。一周后剖殺，其中兩只雞盲腸高度腫脹和大量出血，黏膜面有大量出血點(diǎn)，腸腔中充滿凝血和腸黏膜碎片，取盲腸內(nèi)容物和盲腸黏膜刮取物鏡檢可見卵囊，其他腸道無肉眼可見病變，鏡檢內(nèi)容物中也未見球蟲卵囊，取小腸中段內(nèi)容物鏡檢，未見裂殖子。因此可確定單卵囊分離所獲得的這株球蟲的裂殖生殖和卵囊寄生部位均在盲腸。用飽和鹽水漂浮法收集糞便和盲腸球蟲卵囊，在顯微鏡下觀察，所收集的球蟲卵囊呈寬卵圓形，卵囊壁為二層，光滑，無卵膜孔，有一圓形極粒位于窄端。用裝有測(cè)微尺的顯微鏡測(cè)量100個(gè)球蟲卵囊，測(cè)得的卵囊長(zhǎng)徑集中在18.00μm~24.00μm，寬徑集中在15.00μm~21.60μm，將其繪成折線圖（圖 1、圖 2），大小范圍為16.80~28.80μm×14.40~25.20μm，平均大小為 21.54±0.24μm×17.85±0.24μm，形狀指數(shù)為1.21。收集到的球蟲卵囊在28℃的溫箱中培養(yǎng)，檢測(cè)的最短孢子化時(shí)間為19h，將其孢子化的卵囊置于顯微鏡下觀察，孢子囊有斯氏體，無內(nèi)外殘?bào)w。根據(jù)上述觀測(cè)結(jié)果，參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，可確定該株球蟲為柔嫩艾美耳球蟲，并命名為E.t SX01323。

3.2 柔嫩艾美耳球蟲致病性試驗(yàn)

感染初期，試驗(yàn)雞精神、飲食欲無明顯的異常。感染4天后，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組雞均表現(xiàn)為飲食欲減少，羽毛逆立，糞便變稀，感染后第5天，雞群出現(xiàn)糞便帶血，精神倦怠，雙翅下垂，臥地弓背或尾羽上撅，肛門周圍和后覆尾羽粘有紅褐色血性糞便。并有部分雞只死亡，隨感染劑量增加死亡率也相對(duì)增高。剖檢病死雞，可見盲腸壁增厚、腫脹、出血，腸腔中充滿凝血塊和盲腸粘膜碎片及干涸的盲腸芯。肉眼觀察其他腸段無明顯變化。

除對(duì)照組外，各感染組雛雞，卵囊排出量和血便量隨攻毒量增大而增多，其半數(shù)感染量為0.99×104個(gè)／只；相對(duì)增重率、ACI值隨攻毒量的增加而減小，攻毒量由1×103增到10×104個(gè)／只時(shí)，雛雞相對(duì)增重率由55.27%降到了29.28%，可見柔嫩艾美耳球蟲對(duì)雛雞增重的影響很大，且劑量越大，對(duì)增重的影響越大，對(duì)照組雛雞的ACI值為200，而感染雛雞在 1×103~2×104個(gè)／只范圍內(nèi)，ACI值在 152.81±1.33~100.45±0.70范圍內(nèi)，可反映出柔嫩艾美耳球蟲對(duì)雛雞的損傷較輕微，感染量在5×104~10×104個(gè)／只范圍內(nèi)，雛雞的ACI值降到了76.99±2.15~55.63±1.18范圍內(nèi)，此時(shí)柔嫩艾美耳球蟲對(duì)雛雞的損傷已較嚴(yán)重，可見柔嫩艾美耳球蟲對(duì)雛雞ACI值的影響也很大，且隨著劑量增大，對(duì)ACI值的影響越來越大；雛雞的攻毒量在5×103個(gè)／只以內(nèi)不引起死亡，攻毒量在1×104個(gè)／只以上，死亡率隨攻毒量增加而增高，其半數(shù)致死量為7.52×104個(gè)/只；試驗(yàn)各感染組病理剖檢均觀察到不同程度的腸道病變，隨著感染劑量的增加，病變程度越來越嚴(yán)重，當(dāng)攻毒量在1×103~5×103個(gè)／只以內(nèi)時(shí)，雛雞盲腸壁見少量散在出血點(diǎn)，內(nèi)容物中有少量血液，攻毒量在1×104~10×104個(gè)／只以內(nèi)，盲腸高度腫脹，腸腔內(nèi)充滿凝血和脫落腸黏膜。結(jié)果見表1、2和圖3、4。

4 分析與討論

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球蟲分布范圍廣，危害大，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，球蟲病對(duì)于雛雞而言，常常是毀滅性的[8]。其中，致病力最強(qiáng)的為柔嫩艾美爾球蟲（E．tenella）和毒害艾美爾球蟲（E．nacatrix），每年給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的損失。因此，許多學(xué)者致力于球蟲方面的研究。要想深入研究每一種球蟲的特性就需要提取品種單一的球蟲卵囊進(jìn)行研究；同時(shí)生物技術(shù)的進(jìn)步為球蟲的活苗，基因工程苗[9]及球蟲遺傳變異的研究提供了更為廣闊的空間，而獲得品種單一、基因型純凈的球蟲卵囊是這些研究能否順利進(jìn)行的前提。目前，球蟲單卵囊分離技術(shù)是獲得球蟲純種體系的重要手段[10]，是上述各種研究的基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲（E．tenella）顯著的特征是寄生于盲腸和臨床上出現(xiàn)明顯的血便，本實(shí)驗(yàn)分離純化的這株球蟲具有此特征，在顯微鏡下其卵囊結(jié)構(gòu)、測(cè)得的卵囊和孢子囊大小、卵囊形狀指數(shù)、潛隱期和最短孢子化時(shí)間均為柔嫩艾美耳球蟲的特征，且在小腸中段亦未見到裂殖子。因此，鑒定分離所的這株純種球蟲為柔嫩艾美耳球蟲（E．tenella）。

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)劑量梯度對(duì)所分離出的柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行致病性觀察，無論從攻毒劑量，還是檢測(cè)指標(biāo)（增重率、盲腸病變、ACI值、半數(shù)感染量、半數(shù)致死量）均可得出該株柔嫩艾美耳球蟲的毒力很強(qiáng)，應(yīng)該引起人們足夠的重視。且該株柔嫩艾美耳球蟲可供以后柔嫩艾美耳球蟲的進(jìn)一步深入研究。

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