唐夢君 ，高玉時 ，周 生 ，張小燕 ，唐修君 ，蒲俊華 ，葛慶聯(lián)

（1.農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，江蘇揚州 225003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚州 225003）

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria.monocytogenes LM）是李斯特菌屬中的一種，LM廣泛分布于自然界，在肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品和蔬菜類都能檢出[1-2]。該菌為重要人獸共患和食源性病原菌，可引起人和多種動物的胃炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等。新生兒、老人及免疫低下者更易感染發(fā)病，病死率高達30%[2]。因此，建立一種快速、有效的檢測方法對各種食品進行質(zhì)量監(jiān)督，及時檢測出食品中是否含有該菌非常重要。

目前LM快速檢測方法包括傳統(tǒng)的細菌分離鑒定、免疫檢測、PCR方法等。細菌分離鑒定法操作繁瑣、耗時長；免疫檢測操作簡便，可在同一時間內(nèi)檢測大量樣品，但由于存在菌體及鞭毛抗原交叉反應(yīng)，難以進行李斯特菌種間特異性鑒別[3]；PCR法具有特異性強、靈敏度高和速度快等優(yōu)點，但因PCR技術(shù)對模板DNA的質(zhì)量有較高要求，需要的熱循環(huán)設(shè)備價格昂貴而很難得到推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplication，LAMP)是 Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其原理是針對目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在等溫65℃左右，幾十分鐘，即可實現(xiàn)核酸的高效擴增[4]。4條引物對靶序列的6個特異序列區(qū)域的識別，保證了LAMP擴增的高度特異性。LAMP不需要模版的熱變性[5]，長時間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴增，不會因溫度改變而浪費時間。有無肉眼可見的焦磷酸鎂的白色沉淀[6-7]，成為判斷核酸是否擴增的最簡單的方法。增加環(huán)引物的LAMP方法，使反應(yīng)速度可提高1/2~1/3[8]。因此，LAMP與PCR方法相比具有更高的特異性和高效性[9-11]。近來研究表明，LAMP已成功應(yīng)用于各種細菌和病毒的快速檢測[12-14]。本實驗以單核細胞增生李斯特菌的hlyA基因為靶序列設(shè)計三對引物（包括內(nèi)外引物和一對環(huán)引物），并比較了LAMP和PCR方法的特異性與靈敏性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑 電熱恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機（HITACHI）、PCR 擴增儀（eppendorf）、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀等；Bst DNA聚合酶購自New England Biolab 公司；甜菜堿（Betain），購自Sigma 公 司 ；TaqDNA、dNTP、DNA Marker、Cla I酶等分子生物學(xué)試劑購自大連寶生物試劑有限公司。

1.2 菌種 單增李斯特菌（GIM1.229）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50115)、痢疾志賀氏菌（CMCC51252)、豬霍亂沙門氏菌（ATCC13312）、福氏志賀氏菌（CMCC51572）、宋氏志賀氏菌（CMCC51592）購自廣東省微生物菌種保藏中心；副溶血性弧菌（ATCC17802）、豬霍亂沙門氏菌（ATCC14028）、 大 腸 桿 菌（ATCC8739）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)Gen-Bank公布的單核細胞增生李斯特菌hlyA基因序列中的保守序列，采用引物設(shè)計軟件Primer Explorer4.0進行設(shè)計，得到一套特異性的LAMP引物，包括外引物 F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP以及環(huán)引物L(fēng)F、LB，引物序列見表1。引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

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1.4 DNA模版的制備 細菌基因組DNA提取方法參照文獻[15]，具體步驟為：取一接種環(huán)的細菌培養(yǎng)物（約10μL）于1.5 mL離心管中，加入 50μL NaOH（25 mmol/L）混勻，100℃水浴 10 min，加入 4μL Tris-HCl（1 M，pH8.0）進行中和，混懸液4℃20 000 g離心5 min，去沉淀，上清作為LAMP和PCR的DNA模板。

1.5 LAMP擴增 配制LAMP反應(yīng)體系25μL，包括：10xbst buffer 2.5 μL，MgSO4（25 mmol／L）4 μL、dNTP（10 mmol／L）4 μL、Betaine（5 mol／L）4μL、內(nèi)引物（20 μmol／L）各 1.5μL、外引物（10 μmol／L）各 0.5μL、環(huán)引物（10μmol／L）各0.5μL、Bst DNA 聚合酶大片段（8 U／μL）1μL、DNA模板 2μL以及ddH2O 2.5μL?；靹?，于65℃溫育60 min，80℃滅活10 min中止反應(yīng)。產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時通過向擴增產(chǎn)物中加入1μL SYBRGREEN I，觀察顏色變化判斷擴增與否。

1.6 LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定 取2 μL LAMP擴增產(chǎn)物，加入1μL ClaI、2μL緩沖液及 ddH2O 15μL，輕輕地混合后離心，在37℃酶切1 h，2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.7 PCR擴增 單核細胞增生李斯特菌PCR反應(yīng)的引物是檢測LM的LAMP反應(yīng)的兩條外引物（F3和B3），見表1。PCR擴增反應(yīng)體系為：10 ×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、Taq酶 0.25μL、F3和 B3各 1 μL、模板 2μL，ddH2O 為 14.25 μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.8 LAMP方法特異性試驗 以10株實驗菌株的基因組DNA為模板，用建立的LAMP方法進行擴增，電泳觀察擴增結(jié)果，驗證方法特異性。同時用PCR法進行平行檢測。

1.9 LAMP方法靈敏度試驗

1.9.1 細菌純培養(yǎng)檢測靈敏度 單核細胞增生李斯特菌接種于新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。用生理鹽水進行10倍系列稀釋。采用稀釋平板法，測定其純培養(yǎng)物活菌數(shù);同時從每稀釋度菌液中取100 μL菌液離心去上清，再加入50μL NaOH（25 mmol/L）混勻，100 ℃水浴10 min， 加 入 4 μL Tris-HCl（1 mol/L，pH8.0）進行中和，混懸液 4 ℃20 000 g離心5 min，去細胞沉淀，取2μL上清作為DNA模板進行LAMP擴增。

1.9.2 人工污染樣的檢測靈敏度 取經(jīng)傳統(tǒng)方法和常規(guī)PCR方法預(yù)檢單核細胞增生李斯特菌陰性的禽肉25 g，放入225mLLB1培養(yǎng)基中進行均質(zhì)，取100μL稀釋菌液分別接種到900μL均質(zhì)液中，旋渦混勻，900g離心1 min，上清轉(zhuǎn)入一干凈EP管中，再10 000 g離心5 min，去上清，沉淀加入 100μL NaOH（25 mmol/L）混勻，100℃水浴 10min，加入 8μL Tris-HCl（1 M，pH8.0）進行中和，混懸液4℃20 000 g離心5 min，去沉淀，取4μL上清作為LAMP和PCR的DNA模板進行擴增。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測方法的建立 本研究以設(shè)計的一套特異性引物對單核細胞增生李斯特菌基因組DNA進行LAMP擴增。單核細胞增生李斯特菌基因組DNA泳道產(chǎn)生階梯狀條帶，以水作為模板的陰性對照未有條帶出現(xiàn)（圖1A）；另外，向擴增產(chǎn)物中加入 1μL SYBR GREEN I，單核細胞增生李斯特菌擴增產(chǎn)物與染料混合后顏色由橙色變?yōu)榫G色，而陰性對照仍為橙色（如圖1B）。結(jié)果表明此套LAMP引物能夠有效擴增單核細胞增生李斯特菌hlyA基因。

2.2 LAMP擴增產(chǎn)物的酶切鑒定圖2顯示了單核細胞增生李斯特菌LAMP擴增產(chǎn)物經(jīng)ClaI酶切消化后的結(jié)果。理論計算，擴增產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶ClaI消化后應(yīng)為2條分子量約為250 bp和150 bp條帶。圖中結(jié)果與理論值基本相符。

2.3 LAMP檢測單核細胞增生李斯特菌的特異性結(jié)果 用建立的LAMP方法分別對10株實驗菌株進行擴增，特異性試驗結(jié)果如圖3所示，LAMP法和PCR法均具有高特異性，僅單核細胞增生李斯特菌得到陽性結(jié)果，其它9株非單核細胞增生均為陰性。

2.4 LAMP檢測單核細胞增生李斯特菌的靈敏度結(jié)果 經(jīng)平板計數(shù)，原始菌液濃度為5.44×108cfu／mL。10倍系列稀釋菌液進行檢測，結(jié)果顯示，LAMP法細菌純培養(yǎng)物和人工污染樣品的檢測限約為5.44×102cfu／mL，PCR法細菌純養(yǎng)物和人工污染樣品的檢測限為5.44×104cfu／mL（圖4）。

3 討論

單核細胞增生李斯特菌廣泛存在于自然界中，可在極端的環(huán)境（低溫和高鹽）中生長，使它很難在食物鏈中被去除，所以單增李斯特菌在各種食品中均可造成污染，歐美國家曾因此發(fā)生多次單增李斯特菌引起的食物中毒，食源性的李斯特菌病已成為一個公共衛(wèi)生問題。目前我國主要的檢測方法為傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法結(jié)合顯色培養(yǎng)基和基于生化反應(yīng)的VITEK系統(tǒng)進行檢測，操作較復(fù)雜，時間較長，而ELISA試劑盒盡管快速、簡便、靈敏，但成本較高。近年來隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR[16-18]、多重 PCR[19-20]、實時熒光PCR[21-22]等在單核細胞增生李斯特菌的檢測研究中得到了應(yīng)用。但這些方法都要耗時4~5 h，并且既要昂貴的儀器設(shè)備用于擴增，又要用復(fù)雜的方法對產(chǎn)物進行檢測，從而限制了它們在基層實驗室的推廣。因此，亟需開發(fā)一種快速、靈敏、方便、價廉的檢測方法，以滿足對食品中單核細胞增生李斯特菌的實時檢測。最近研究表明LAMP方法檢測各種食源性致病菌方面具有良好潛力。因此，本研究以單核細胞增生李斯特菌的hlyA基因為靶序列，建立了帶有2條環(huán)引物的LAMP方法。

單核細胞增生李斯特菌主要的毒力因子有：hlyA、actA、plcA、plcB、prfA、mpl。而檢測單核細胞增生李斯特菌常用的靶基因主要有iap、hly、Inl基因[23]。hly基因主要是編碼溶血素O的基因，溶血素為李斯特菌的主要致病因子。hly基因是單核細胞增生李斯特菌比較保守的基因，目前多數(shù)研究都使用hly基因用以檢測單核細胞增生李斯特菌。本研究選擇單核細胞增生李斯特菌hlyA基因作為靶基因建立LAMP檢測方法，對10株實驗菌株進行擴增，只有單核細胞增生李斯特菌得到陽性結(jié)果，而其它菌株均為陰性結(jié)果，因此該方法特異性強。本方法靈敏度高，對于細菌純培養(yǎng)物和人工染菌的檢測限約為5.44×102cfu／mL，這一結(jié)果與文獻報道[15，24]的檢測限基本相符，且該方法的檢測靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，研究表明，LAMP技術(shù)可檢測到10個拷貝數(shù)甚至更低的靶標，在檢測靈敏度上具有更大的優(yōu)勢[25-26]。同時，本研究在LAMP反應(yīng)中添加2條環(huán)引物，環(huán)狀引物與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合的區(qū)域在F2和Fl之間（或是B2和B1之間），以F1到F2的方向或是B1到B2的方向結(jié)合。這樣，莖環(huán)DNA或者與內(nèi)引物雜交，或者與環(huán)狀引物雜交來啟動鏈置換DNA的合成，從而加快了反應(yīng)速度，使擴增時間從60 min縮至30 min，與 Hong 和 Yano 等[27-28]的研究報道相符。

綜上所述，本研究建立的單核細胞增生李斯特菌LAMP檢測方法具有特異性強、靈敏度高、方便快捷、成本低等特點，為單核細胞增生李斯特菌的檢測提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡易的常規(guī)檢測手段，適用于大批量樣品的初篩或野外現(xiàn)場進行定性檢測。

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