于 品，佘銳萍，夏抗抗，李文貴，丁 葉，岳 卓，韓德平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

乙型肝炎是一種廣泛流行、嚴(yán)重危害人類健康的病毒性傳染病，其病原為乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）。乙肝病毒屬于嗜肝病毒科（hepadnaviridae），正嗜肝病毒屬（Orthohepadnavirus）的一員。全球范圍內(nèi)約有3.5億乙型肝炎感染者，每年有近100萬(wàn)人死于由乙型肝炎引起的慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]。而在中國(guó)，普通人群中大約有10%攜帶HBsAg，有些地區(qū)人乙型肝炎的感染率已達(dá)50%以上，在某些人群中甚至高達(dá)79%，HBV感染是肝硬化與肝癌的形成和發(fā)展重要原因之一，HBV感染成為了我國(guó)重癥肝炎的主要原因，病死率高達(dá) 80%[3]。Brumberg（1965）首次發(fā)現(xiàn)澳大利亞土著人血清中的抗原（澳抗），1968年證實(shí)該抗原與肝炎有關(guān)，現(xiàn)稱之為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。此后免疫電鏡用于澳抗的檢查，觀察到病毒顆粒，Dane（1970）報(bào)道了完整的HBV顆粒。近幾年來(lái)，陸續(xù)有從豬，牛，羊，雞，鴨，野生鼠類等動(dòng)物體內(nèi)檢出人乙型肝炎病毒相關(guān)抗原的研究報(bào)道[4-8]，并由此懷疑乙型肝炎是一種人畜共患病。

戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的一種急性病毒性肝炎。其主要流行于亞洲，非洲和拉丁美洲的發(fā)展中國(guó)家[9]，在美國(guó)和歐洲的一些國(guó)家也出現(xiàn)過(guò)地方性流行[10]。在普通人群中，戊型肝炎的死亡率不到1%，但其對(duì)孕婦的致死率卻高達(dá)28%[11]，極大地危害著人類的健康。Meng等2003年首次在豬血清中分離到豬戊型肝炎病毒（SHEV）野毒株[12]，又有人從雞、貓、狗、牛、羊和嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到HEV抗體陽(yáng)性[13-19]，王英華等（2008）在屠宰豬肝中檢出HEV，其結(jié)果從HEV蛋白和基因兩個(gè)角度都證明了屠宰豬肝臟中HEV的存在，并且證明豬的HEV與人的HEV有很大的相關(guān)性[20]。Li等2009年報(bào)道，在北京地區(qū)不同的養(yǎng)殖條件下，屠宰豬HEV血清陽(yáng)性率高達(dá)到76.6%-90%，其與人源毒株HEV的同源性在96%以上[21]。HEV已經(jīng)作為了一種重要的人畜共患病受到了人們的重視。

SD大鼠作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其病原的控制不僅關(guān)系到相關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，而且會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)人員等暴露人群的健康。而SD大鼠HBV和HEV的感染情況并未見(jiàn)有報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)53例SD大鼠肝臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、HE染色和Mallory三色染色，統(tǒng)計(jì)SD大鼠肝臟內(nèi)乙型肝炎和戊型肝炎相關(guān)抗原的陽(yáng)性率，以及乙肝病毒和戊肝病毒感染對(duì)肝臟造成的病理?yè)p傷等，初步了解SD大鼠肝臟內(nèi)HBV和HEV感染情況，為進(jìn)一步揭示人類乙型肝炎和戊型肝炎的發(fā)病機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共計(jì)53只21日齡清潔級(jí)SD大鼠。

1.1.2 試劑 兔抗人乙肝病毒核心抗原（HBcAg）多克隆抗體，鼠抗人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）單克隆抗體，兔抗人HEV單克隆抗體，SP免疫組化染色試劑盒，均購(gòu)自北京中山金橋生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 SD大鼠經(jīng)頸靜脈放血處死，無(wú)菌采集其肝臟（約1 cm×1 cm×2 cm）樣本，用2.5%多聚甲醛-戊二醛混合固定液固定。

1.2.2 切片制作 固定好的肝組織經(jīng)修塊、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，然后制作5張厚4μm的連續(xù)切片，備用。

1.2.3 免疫組化染色 切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，用PBS沖洗5 min×3次；3%H2O2室溫孵育10 min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×3次；正常牛血清白蛋白工作液封閉15 min，傾去血清，滴加一抗工作液，37℃孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育 30 min；PBS沖洗 5 min×3次，DAB顯色液顯色；用蘇木素襯染后，按常規(guī)石蠟切片制作方法脫水、封片后，顯微鏡下觀察。

1.2.4 蘇木素-伊紅（HE）染色和Mallory三色染色法 對(duì) HBcAg、HBsAg和HEV免疫組化檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)的肝臟再進(jìn)行HE染色和Mallory三色染色，觀察其組織病理學(xué)變化。

1.2.5 免疫組化染色結(jié)果判定 鏡下肝組織中乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒相關(guān)抗原陽(yáng)性信號(hào)呈現(xiàn)棕紅色或棕黃色顆粒或團(tuán)塊狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟中HBcAg、HBsAg免疫組化檢測(cè)結(jié)果

53例SD大鼠肝臟中HBcAg、HBsAg免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表1和表2。由表1可見(jiàn)，在被檢的53例SD大鼠肝臟中，檢出了HBcAg、HB-sAg雙陽(yáng)性的有34例，占被檢樣品總數(shù)的66.15%；HBsAg陽(yáng)性但HBcAg呈陰性的有13例，占總數(shù)的24.53%；HBcAg陽(yáng)性但HBsAg為陰性的有4例，占總數(shù)的7.55%；HBcAg、HBsAg雙陰性的有2例，占總數(shù)的3.77%。由表2可見(jiàn)，在被檢的53例SD大鼠肝臟中，有47例呈HBsAg陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率為88.68%；有38例呈HBcAg陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率為71.70%。這表明，在53例SD大鼠肝臟中乙型肝炎病毒抗原的總檢出率高達(dá)96.23%。

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2.2 HBV抗原在肝臟中的定位

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HBcAg免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布在肝被膜下和肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)。以核漿混合型（95%）為主（圖 1，A），其次為胞核型（5%）（圖 1，B），各例肝臟肝細(xì)胞內(nèi)的HBcAg免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物強(qiáng)度不一。

HBsAg免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布在肝被膜下和肝小葉中央?yún)^(qū)的靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)。以胞核胞漿胞膜型（68.09%）為主（圖 1，C），其次為胞核胞膜型（31.91%）（圖 1，D），各例肝臟肝細(xì)胞內(nèi)的HBsAg免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物強(qiáng)度不一。在不加一抗的陰性染色對(duì)照片中未見(jiàn)任何棕紅色陽(yáng)性反應(yīng)信號(hào)（圖 1，I）。

2.3 肝臟中HEV免疫組化檢測(cè)結(jié)果

53例SD大鼠肝臟中HEV免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表3。由表3可見(jiàn)，在被檢的53例SD大鼠肝臟中，檢出了HEV陽(yáng)性的有53例，占被檢樣品總數(shù)的100%。

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2.4 HEV抗原在肝臟中的定位

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HEV免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布在肝被膜下和肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)。以核漿膽管混合型（81.13%）為主（圖1，E、G、H），其次為胞核膽管混合型（8%）（圖 1，F(xiàn)），另外胞核型和膽管型各占1.89%，各例肝臟肝細(xì)胞內(nèi)的HEV免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物強(qiáng)度不一。在不加一抗的陰性染色對(duì)照片中未見(jiàn)任何棕紅色陽(yáng)性反應(yīng)信號(hào)（圖1，I）。

2.5 HE染色結(jié)果

光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)的肝臟組織均有不同程度的病理變化。主要表現(xiàn)有：肝細(xì)胞變性，局灶性或散在單個(gè)性壞死（圖 2，B、E）；有的肝小葉中央靜脈淤血（圖2，E）；常見(jiàn)肝小葉間或小葉內(nèi)淋巴細(xì)胞彌散性或局灶性浸潤(rùn)（圖2，A）；有的可見(jiàn)小葉間膽管增生（圖 2，C、D、E），并常見(jiàn)有纖維結(jié)締組織增生現(xiàn)象（圖2，D、F）。

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在免疫組化陽(yáng)性的肝臟樣品中，有35%的肝組織中見(jiàn)有淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；33%的肝臟出現(xiàn)了肝細(xì)胞變性、壞死；17%的肝臟肝細(xì)胞發(fā)生萎縮病變；41%的肝臟匯管區(qū)膽管增生；22%的肝組織中纖維結(jié)締組織增生。說(shuō)明HBV和HEV感染對(duì)大鼠的肝臟造成了明顯的損傷作用。

2.6 Mallory三色染色法結(jié)果

在免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)的SD大鼠肝臟中，鏡檢發(fā)現(xiàn)22%（12/53）的肝組織中有纖維結(jié)締組織增生，并且發(fā)現(xiàn)在有些病變比較嚴(yán)重的肝臟中，纖維組織已伸入肝小葉內(nèi)，有的肝血竇的網(wǎng)狀纖維有膠原化的趨勢(shì)，說(shuō)明這些SD大鼠肝臟的炎癥已轉(zhuǎn)為慢性。

3 討論

肝臟作為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)最大的腺體，具有生物轉(zhuǎn)化、分泌和排泄等多種生物化學(xué)功能，是多種物質(zhì)代謝的中樞。肝臟獨(dú)特的雙重血液供應(yīng)，使得肝細(xì)胞可以從肝動(dòng)脈中獲得充足的氧及代謝物，并且又可以從門靜脈中獲取大量由腸道吸收的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為肝臟的各種物質(zhì)代謝提供了基礎(chǔ)。肝臟還具有雙重的輸出通道，肝靜脈可以將肝內(nèi)的代謝產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)狡渌M織利用或排除，同時(shí)膽道系統(tǒng)將肝分泌的膽汁及代謝廢物排入腸道。另外，肝組織中還存在多種免疫細(xì)胞，其中包括肝巨噬細(xì)胞（庫(kù)普弗細(xì)胞）、大顆粒淋巴細(xì)胞、肝樹(shù)突狀細(xì)胞等，這些細(xì)胞能夠捕獲和呈遞血液中的病原微生物及其代謝產(chǎn)物，使肝臟在抗感染免疫中發(fā)揮一定的作用。如此重要的器官，其結(jié)構(gòu)和功能正常與否關(guān)系到整個(gè)機(jī)體的健康狀態(tài)，病毒性肝炎是威脅肝臟功能的重要因素之一，嚴(yán)重地威脅著人類和動(dòng)物的健康，人類病毒性肝炎的蔓延如此之快，可能與動(dòng)物病毒性肝炎感染情況有關(guān)，尤其是家畜、家禽可能在病毒性肝炎的傳播中起到了不可小視的作用。

自從 Brumberg（1965）首次發(fā)現(xiàn)澳抗，Dane（1970）報(bào)道了完整的HBV顆粒以來(lái)，近幾年來(lái)，陸續(xù)有從豬，牛，羊，雞，鴨，野生鼠類等動(dòng)物體內(nèi)檢出人乙型肝炎病毒相關(guān)抗原的研究報(bào)道[1-5]，并懷疑乙型肝炎是一種人畜共患病，乙型肝炎是一種世界性的傳染病，是肝硬化和肝癌發(fā)病的重要誘因，其公共衛(wèi)生學(xué)意義也越來(lái)越引起人們的重視。

戊型肝炎已經(jīng)被公認(rèn)是一種人畜共患病，Emerson（2003）報(bào)道豬是戊型肝炎病毒最主要的動(dòng)物貯存宿主[22]，近年來(lái)，在牛、羊、雞、犬等畜禽及野生動(dòng)物中也檢測(cè)到抗HEV抗體或HEV RNA[23]，動(dòng)物病毒株是引起人散發(fā)性戊型肝炎的主要病原。

對(duì)于SD大鼠感染HBV和HEV的情況，目前未見(jiàn)報(bào)道，本研究首次采用免疫組化的方法在SD大鼠的肝組織中顯現(xiàn)并定位了人乙肝病毒和戊肝病毒相關(guān)抗原。本研究檢測(cè)的53例SD大鼠肝臟中人乙肝病毒抗原的總檢出率達(dá)96.23%，人戊肝病毒抗原的檢出率高達(dá)100%，鏡下顯示，位于肝被膜附近的肝細(xì)胞中，乙型肝炎和戊型肝炎相關(guān)抗原陽(yáng)性信號(hào)主要分布于肝細(xì)胞核中，呈散在分布，而遠(yuǎn)離被膜的肝細(xì)胞胞漿和部分胞核可見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)，胞漿中多呈成片分布，這可能與HBV和HEV感染階段不同，病毒存在的部位不同有關(guān)。所有肝組織的匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明HEV可能是通過(guò)膽汁的分泌而進(jìn)入腸道的。這與報(bào)道的豬等動(dòng)物戊型肝炎病毒抗原分布情況基本一致。組織形態(tài)學(xué)觀察表明，免疫組化陽(yáng)性的肝臟HE染色切片都具有典型的病毒性肝炎的病變特征：35%的肝組織中見(jiàn)有淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；33%的肝臟出現(xiàn)了肝細(xì)胞變性、壞死；17%的肝臟肝細(xì)胞發(fā)生萎縮病變；41%的肝臟匯管區(qū)膽管增生；22%的肝組織中纖維結(jié)締組織增生，并常見(jiàn)有不同程度的纖維結(jié)締組織增生現(xiàn)象；Mallory三色染色法22%的肝組織中有纖維結(jié)締組織增生，并有網(wǎng)狀纖維膠原化，提示這些肝組織有轉(zhuǎn)為慢性肝炎的趨勢(shì)。這表明SD大鼠的HBV和HEV感染對(duì)其肝臟造成了明顯的損傷作用，表現(xiàn)為明顯的病毒性肝炎的病理學(xué)變化。但其病原與人乙肝病毒和戊肝病毒的同源性有待進(jìn)一步研究。

由于缺乏合適的體內(nèi)外模型，HBV的生物學(xué)研究及治療方法進(jìn)展緩慢，因此，建立一種有效的HBV感染模型，是探索其感染機(jī)制，發(fā)病機(jī)理，尋找有效的防治方法及開(kāi)展抗HBV藥物的篩選的重要前提。國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍采用鴨HBV感染1~3日齡雛鴨建立乙肝動(dòng)物模型，是研究乙肝發(fā)病機(jī)制、病毒復(fù)制過(guò)程及篩選有效治療藥物的理想模型，可作為抗病毒藥物臨床前評(píng)價(jià)的工具，用于研究藥物的藥效、藥動(dòng)學(xué)以及毒理學(xué)，也可用于評(píng)價(jià)免疫治療的療效[24]。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型也應(yīng)用于HBV感染過(guò)程和感染后的免疫病理改變，還有助于發(fā)展新的抗病毒治療方法[25]。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為研究病毒在體內(nèi)的復(fù)制提供了良好的模型，但同時(shí)也具有很多缺陷[26]。HEV多種動(dòng)物宿主的發(fā)現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物模型，其中包括非人類靈長(zhǎng)類：猴、食蟹猴、非洲綠猴、短尾猴和黑猩猩[27]。豬作為HEV動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)感染了豬HEV和人HEV株，這提供了HEV跨物種傳播的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[28]。有研究表明，野生嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到HBV和HEV的感染，SD大鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，本研究中檢測(cè)到的免疫組化陽(yáng)性的大鼠肝臟其病理變化與人的病毒性肝炎的病變相似，陽(yáng)性信號(hào)分布也與人的HBV和HEV相似，所以，大鼠能否成為進(jìn)行HBV和HEV研究的動(dòng)物模型，有待深入研究。

4 結(jié)論

SD大鼠可以自然感染HBV和HEV，HBV主要在肝細(xì)胞的胞漿胞核中分布，HEV主要分布于肝細(xì)胞的胞漿胞核和小葉間膽管上皮中，并且會(huì)使其肝臟出現(xiàn)典型的病毒性肝炎的病變特征，部分肝臟還表現(xiàn)有纖維化的趨勢(shì)。

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