朱秀靈，戴清源，蔡為榮，王 建

（安徽工程科技學(xué)院生物化學(xué)工程系，安徽蕪湖241000）

響應(yīng)面法優(yōu)化鯽魚魚鱗酸溶性膠原蛋白提取工藝

朱秀靈，戴清源，蔡為榮，王 建

（安徽工程科技學(xué)院生物化學(xué)工程系，安徽蕪湖241000）

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對影響酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）提取效果的3個因素即乙酸濃度、液料比和提取時間進行了優(yōu)化，建立并分析了各因素與ASC得率關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明：ASC最佳提取工藝條件為：乙酸濃度0.41mol/L，液料比12mL/g，提取時間54.81h，在此工藝條件下，ASC最高得率（以干基計）理論值為20.97%，而實測值可達20.68%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差為1.38%。ASC的相對溶解度在pH4時最大，當(dāng)NaCl濃度低于3%（mg/mL）時，ASC的相對溶解度基本不變，當(dāng)NaCl濃度大于3%（mg/mL）時，相對溶解度迅速降低，但都在40%以上。

酸溶性膠原蛋白，響應(yīng)面法，優(yōu)化，魚鱗

膠原蛋白不僅是構(gòu)成生物體的重要成分（如動物皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、軟骨及血管等）［1］，而且作為原料已被廣范應(yīng)用到食品、醫(yī)藥及化妝品等眾多領(lǐng)域［2-3］。膠原蛋白的主要來源最初僅限于陸生動物如牛、豬等的骨骼和皮膚［4］。然而，近幾年來，由于瘋牛病及口蹄疫等疾病的爆發(fā)使人們對這些來源的膠原蛋白的安全性甚是擔(dān)憂［5］。歐美、日本等國家相繼出臺了不少法規(guī)，限制從牛等哺乳動物皮骨中的提取物用于食品、醫(yī)藥等對人體直接影響的產(chǎn)品中［6］。另外，來源于豬的膠原蛋白由于宗教信仰問題，其應(yīng)用也受到限制［7］。基于此，必須尋找新的膠原蛋白來源。魚類加工副產(chǎn)物——皮膚、骨、魚鱗等富含膠原蛋白，以此為原料提取膠原蛋白的報道較多，但大多以深海魚類為主，而以淡水魚魚鱗為原料的報道尚少［8］。本實驗以淡水魚鯽魚魚鱗為原料，采用傳統(tǒng)的酸法提取工藝，利用響應(yīng)面分析法對酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）提取工藝進行優(yōu)化，并初步探討pH及NaCl濃度對ASC溶解度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗 購于本地集貿(mào)市場，活魚屠宰后的魚鱗用清水洗凈，真空干燥（25℃），粉碎過80目篩，4℃保存，備用；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、乙酸、鹽酸、檸檬酸、乳酸、氯化鈉等 均為國產(chǎn)分析純；牛血清白蛋白（BSA） 廣州蕊特生物科技公司。

SP-754型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DZX-型（60508）真空干燥箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；L-550臺式大容量離心機 湘儀離心機有限公司；PHS-2C數(shù)顯酸度計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯽魚魚鱗中ASC的提取工藝流程 魚鱗粉（質(zhì)量m1，g）→堿液處理→脫脂→脫鈣→酸解→鹽析→透析→真空干燥（質(zhì)量為m2，g）

具體操作參照文獻［3，9］進行，則 ASC得率η（%，以干基計）=m2/m1×100%。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 應(yīng)用Box-Behnken中心組合方法進行三因素三水平的實驗設(shè)計。在單因素實驗基礎(chǔ)上，以酸液濃度，液料比，提取時間3個因素為自變量，分別以x1、x2、x3表示，按方程Xi=（xi-x0）/△x對自變量進行編碼（Xi為自變量的編碼值，xi為自變量的真實值，x0為實驗中心點處自變量的真實值，△x為自變量的變化步長）。并以自變量的編碼值+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，ASC得率Y為響應(yīng)值，實驗自變量因素編碼及水平見表1。

表1 實驗因素編碼及水平表

1.2.3 紫外可見光譜分析 準確稱取一定質(zhì)量的ASC溶于0.02mol/L乙酸水溶液，得到2mg/mL ASC溶液［10-11］。在波長范圍190～400nm下測定其吸光度，記錄最大吸收波長。

1.2.4 ASC溶解度實驗 參照文獻［10，12-13］進行，先用0.5mol/L乙酸溶解膠原蛋白配制成質(zhì)量濃度分為3mg/mL和6mg/mL的膠原蛋白溶液。然后分別考察 pH及 NaCl濃度對膠原蛋白溶解度的影響。

1.2.4.1 pH對ASC溶解度的影響 取10支離心管，各加入 8mL 3mg/mL的 ASC溶液，并用 6mol/L NaOH或6mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，然后加入蒸餾水（將其pH調(diào)整到與膠原蛋白pH相同）至溶液體積為10mL，磁力攪拌 30min后進行離心（30min，1000r/min）。測定上清液中蛋白質(zhì)含量（mg/mL），計算ASC相對溶解度。

1.2.4.2 NaCl濃度對ASC溶解度的影響 將NaCl溶解于0.5mol/L乙酸中，制得質(zhì)量濃度分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%（mg/mL）的NaCl溶液。分別取5mL不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液于離心管中，各加入5mL 6mg/mL的ASC溶液，混勻，則混合溶液中NaCl質(zhì)量濃度分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%（mg/mL）。然后離心（30min，1000r/min），測定上清液中蛋白質(zhì)含量（mg/mL），計算ASC相對溶解度。

1.2.4.3 ASC相對溶解度計算 以牛血清白蛋白為標(biāo)準，參照文獻［14］對上清液中蛋白質(zhì)含量（mg/mL）進行測定。

式（1）中：V1為ASC溶液的體積，mL；C1為ASC溶液的濃度，mg/mL；V2為離心后上清液的體積，mL；C2為上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外可見吸收光譜分析

通過測定ASC在波長190～400nm下的吸光度，得知最大吸收波長為222nm，這與ASC多肽鏈中含有的C=O、COOH、CONH2基團有關(guān)［10］。絕大部分蛋白質(zhì)因含有一定量的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm處具有最大吸收峰。苯丙氨酸在251nm處有最大吸收峰。而膠原蛋白在280nm及251nm處無顯著吸收峰［11］。因此，實驗所得蛋白質(zhì)為膠原蛋白。

2.2 不同酸對ASC得率的影響

稱取4份質(zhì)量均為5g的魚鱗，按照1.2.1操作，分別以0.5mol/L的鹽酸、乙酸、檸檬酸、乳酸為提取劑，液料比為10mL/g，提取時間為72h，ASC得率見圖1。由圖1看出，不同酸液提取ASC得率不同，按得率由大到小依次為乙酸、檸檬酸、鹽酸、乳酸。故實驗選擇乙酸作為ASC的提取劑。

圖1 酸對ASC得率的影響

2.3 乙酸濃度對ASC得率的影響

稱取5份質(zhì)量均為5g的魚鱗，以液料比為10mL/g分別加入濃度為 0.20、0.35、0.50、0.65、 0.80mol/L的乙酸，提取時間為72h，按1.2.1操作進行提取，結(jié)果如圖2所示。

表3 回歸方程的方差分析

圖2 乙酸濃度對ASC得率的影響

乙酸濃度對ASC得率的影響如圖2，乙酸濃度為0.2～0.5mol/L時，ASC得率隨著乙酸濃度的增加而增大；當(dāng)乙酸為0.5mol/L時，得率最大為17.58%；當(dāng)乙酸濃度大于0.5mol/L時，得率反而下降。這可能是隨著乙酸濃度增大，溶液pH降低，膠原蛋白變性，致使溶解度降低，其得率也相應(yīng)降低。故乙酸濃度以0.50mol/L較為合適。

2.4 液料比對ASC得率的影響

稱取5份質(zhì)量均為5g的魚鱗，以液料比為5、10、15、20、25mL/g分別加入0.50mol/L的乙酸，提取時間為72h，按1.2.1操作進行提取，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)液料比為5～10mL/g時，ASC得率急劇增加，液料比為10～15mL/g時，得率增加也較快，但相對于前者增加幅度較??；當(dāng)液料比為15～25mL/g時，得率趨于平緩?？紤]到酸液使用量大，后處理困難及成本高等問題，故液料比以10～15mL/g為合適范圍。

圖3 液料比對ASC得率的影響

2.5 提取時間對ASC得率的影響

稱取7份質(zhì)量均為5g的魚鱗，以液料比10mL/g加入0.50mol/L的乙酸，提取時間分別為24、36、48、60、72、84、90h，按1.2.1操作進行提取，結(jié)果如圖4所示。

由圖4得知，當(dāng)提取時間為24～60h，ASC得率隨著提取時間的延長而快速增加；當(dāng)提取時間為60h時，得率達到17.45%；當(dāng)提取時間大于60h，再隨著時間延長，得率增加不明顯。故提取時間以60h為最佳。

圖4 提取時間對ASC得率的影響

2.6 鯽魚魚鱗中ASC提取工藝優(yōu)化

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以乙酸濃度、液料比和提取時間3因素3水平進行響應(yīng)面實驗設(shè)計及分析，實驗因素編碼及水平表見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。以編碼值X1，X2，X3為自變量，以ASC得率Y為響應(yīng)值，采用SAS RSREG程序進行響應(yīng)面分析實驗，結(jié)果見表3，因子經(jīng)過回歸擬合，解得回歸方程為：

表2 ASC提取實驗設(shè)計與結(jié)果

回歸方程（2）的方差分析和參數(shù)估計分別見表3、表4。由表3可知，模型回歸P為0.0009，說明模型回歸高度顯著可靠；一次項、二次項交互作用高度顯著，說明各因素之間不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系；失擬項F值較小，失擬項P為0.2990，表明失擬項不顯著，說明該方程對實驗擬合好，實驗誤差小。因此可以用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。由表4知，對方程影響顯著程度由大到小依次為乙酸濃度、提取時間和液料比，三者對ASC得率的影響均高度顯著，說明三者取值大小直接關(guān)系到ASC得率。模型的回歸系數(shù)R2為0.9811，說明模型響應(yīng)值即ASC得率的變化98.11%來自所選因變量，即乙酸濃度、液料比和提取時間的值，因此，回歸方程可以較好地描述隨機因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

圖5～圖7反映了乙酸濃度、液料比和提取時間三因素交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖5可知，當(dāng)液料比X2一定時，隨著乙酸濃度X1的增加，膠原蛋白得率先是逐漸增大然后又逐漸減少；當(dāng)乙酸濃度一定時，膠原蛋白得率隨著液料比的增大也是先逐漸增大而后又逐漸減少。如編碼X3為0，X1為-0.5時，當(dāng)編碼X2為-0.62時，ASC得率為20.60%，X2為-0.40時，得率為20.79%，X2為-0.09時，得率為20.55%，X2為0.20時得率又降低為19.77%。

表4 參數(shù)估計

圖5 乙酸濃度和液料比對ASC得率影響的響應(yīng)曲面（X3=0）

圖6 液料比和提取時間對ASC得率影響的響應(yīng)曲面（X1=0）

圖6表明，提取時間不變，隨著液料比的增大，ASC得率先是逐漸增大而后又逐漸下降；當(dāng)液料比一定時，提取時間編碼X2在-1至1范圍內(nèi)變化，在一定時間內(nèi)延長提取時間有利于ASC得率的提高，但超過一定值后ASC得率隨時間延長變化不明顯。由圖7得知，乙酸濃度不變時，隨著提取時間的延長，ASC得率也是先增加而后又逐漸減少。而提取時間不變時，隨著乙酸濃度的增大，ASC得率呈下降趨勢。

圖7 乙酸濃度和提取時間對ASC得率影響的響應(yīng)曲面（X2=0）

圖5～圖7表明，ASC得率與乙酸濃度、液料比和提取時間三個因素有關(guān)，且這三個因素存在最佳參數(shù)組合可以滿足ASC得率達到理論最大值。再對三維非線性回歸模型（2）取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，得到如下方程組：

解方程組得X1=-0.8871，X2=-0.5009和X3= -0.5192，根據(jù)編碼值與非編碼值的轉(zhuǎn)換式解得x1= 0.41mol/L，x2=12mL/g，x3=54.81h。即鯽魚魚鱗中ASC最佳提取工藝為乙酸濃度0.41mol/L，液料比12mL/g，提取時間54.81h，由回歸方程可得ASC最高得率理論值可達到20.97%。在該提取工藝條件下，實際測得ASC得率為20.68%（三次平行實驗的平均值，即 n=3），與理論預(yù)測值相比，相對誤差為1.38%，因此，采用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

2.7 ASC的溶解度

按照1.2.4操作，pH及氯化鈉對ASC的影響分別見圖8、圖9。

圖8 pH對ASC溶解度的影響

pH對ASC溶解度影響（見圖8）較大，當(dāng)pH為4時，ASC相對溶解度最大為93.63%；當(dāng)pH為7時，相對溶解度最?。欢鴓H在7～10范圍內(nèi)，相對溶解度又隨著pH增大而逐漸增大。其原因可能是膠原蛋白等電點在7附近，當(dāng)pH接近蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)所帶凈電荷接近零及蛋白質(zhì)肽鏈間疏水相互作用增強，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集、沉淀，相對溶解度降低［13］。當(dāng)pH偏離等電點時，蛋白質(zhì)帶有較多凈電荷，蛋白質(zhì)分子間相互排斥，因此蛋白質(zhì)相對溶解度較高。

圖9 NaCl對ASC溶解度的影響

由圖9看出，當(dāng)溶液中 NaCl濃度低于 3%（mg/mL）時，ASC在0.5mol/L乙酸中的溶解度稍微高于在 NaCl溶液中的溶解度；當(dāng) NaCl濃度為3%～4%時，相對溶解度隨著NaCl濃度增大而迅速下降；當(dāng)NaCl濃度大于4%時，相對溶解度緩慢下降；但是，ASC在NaCl溶液（1%～6%，mg/mL）中的相對溶解度均在40%以上。蛋白質(zhì)在NaCl溶液中溶解度降低原因主要是由于較高離子濃度導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用增強，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生聚集沉淀而使溶解度降低［15］。

3 結(jié)論

利用SAS9.1軟件，采用響應(yīng)面法（RSM）建立了鯽魚魚鱗ASC提取工藝條件的二次多項式數(shù)學(xué)模型，分析了各因素對響應(yīng)值的影響。并對ASC在不同pH及NaCl溶液中的溶解度進行了初步分析。

結(jié)果表明：對響應(yīng)值影響顯著程度由大到小依次為乙酸濃度、提取時間和液料比；二次多項式數(shù)學(xué)模型擬合程度高，實驗誤差小。對響應(yīng)回歸方程進行一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，求出最佳提取工藝條件為：乙酸濃度0.41mol/L，液料比12mL/g，提取時間54.81h，在此條件下，ASC最高得率理論值為20.97%，而實測值可達20.68%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差為1.38%。ASC溶解度與溶液pH及離子強度（NaCl溶液）有關(guān)。當(dāng)pH在等電點時，相對溶解度較低，偏離等電點時，相對溶解度增大，當(dāng)pH為4時，相對溶解度最大為93.63%；當(dāng)NaCl濃度低于3%，離子強度對ASC相對溶解度影響較小，當(dāng)NaCl濃度大于3%時，相對溶解度先是迅速下降而后又趨于平緩，但都在40%以上。

［1］Senaratne LS，Park PJ，Kim SK.Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish（Lagocephalus gloveri）skin［J］.Bioresource Technology，2006，97（2）：191-197.

［2］Morimura S，Nagata H，Uemura Y，et al.Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste［J］.Process Biochemistry，2002，37（12）：1403-1412.

［3］Ogawa M，Portier RJ，Moody MW，et al.Biochemical properties ofbone and scale collagens isolated from the subtropical fish black drum（Pogonia cromis）and sheepshead seabream（Archosargus probatocephalus）［J］.Food Chemistry，2004，88（4）：495-501.

［4］Jongjareonrak A，Benjakul S，Visessanguan W，et al.Isolation and characterisation of acid and pepsin-solubilised collagens from the skin of Brownstripe red snapper（Lutjanus vitta）［J］.Food Chemistry，2005，93（3）：475-484.

［5］Kittiphattanabawon P，Benjakul S，Visessanguan W，et al. Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper（Priacanthus tayenus）［J］.Food Chemistry，2005，89（3）：363-372.

［6］胡業(yè)麗，吳潔，張瑞，等.酸法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白工藝的研究［J］.食品科技，2008，33（2）：209-212.

［7］Sadowska M，Kolodziejska I，Niecikowska C.Isolation of collagen from the skins of Baltic cod（Gadus morhua）［J］.Food Chemistry，2003，81（2）：257-262.

［8］Zhang J，Duan R，Tian Y，et al.Characterisation of acidsoluble collagen from skin of silver carp（Hypophthalmichthys molitrix）［J］.Food Chemistry，2009，116（1）：318-322.

［9］Duan R，Zhang J，Du X，et al.Properties of collagen from skin，scale and bone of carp（cyprinus carpio）［J］.Food Chemistry，2009，112（3）：702-706.

［10］Zeng S，Zhang C，Lin H，et al.Isolation and characterisation of acid-solubilised collagen from the skin of Nile tilapia（0reochromis niloticus）［J］.Food Chemistry，2009，116（4）：879-883.

［11］Yan M，Li B，Zhao X，et al.Characterization of acid-soluble collagen from the skin of walleye pollock（ Theragra chalcogramma）［J］.Food Chemistry，2008，107（4）：1581-1586.

［12］Nalinanon S，Benjakul S，Visessanguan W，et al.Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper（Priacanthus tayenus）［J］.Food Chemistry，2007，104（2）：593-601.

［13］Montero P，Jiménez-Colmenero F，Borderìa J，et al.Effect of pH and the presence of NaCl on some hydration properties of collagenous material from trout（Salmo irideus Gibb）muscle and skin［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1991，54（1）：137-146.

［14］LowryOH，RosebroughNJ，F(xiàn)arrAL，etal.Protein measurement with the folin phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193（1）：256-275.

［15］Fennema OR著.食品化學(xué)［M］.第三版.王璋，許時嬰等譯.北京：中國輕工業(yè)出版社，2003：307-308.

Optimization of extraction acid-soluble collagen from crucian carp scale by response surface methodology

ZHU Xiu-ling，DAI Qing-yuan，CAI Wei-rong，WANG Jian
（Department of Biochemistry Engineering，Anhui University of Technology and Science，Wuhu 241000，China）

Based on the single factor experiments，the effects of acetic acid concentration，ratio of solvent to solid and extraction time on the yield of acid-soluble collagen（ASC）from crucian carp scale were optimized with response surface methodology.A methematical model was established and analyzed to describe the relationships between the factors and the response of the yield of ASC from crucian carp scale.The results showed that the optimum extracting conditions for ASC were as follows：the concentration of acetic acid 0.41mol/L，the ratio of solvent to solid 12mL/g and extraction time 54.81h.Under the optimum conditions，the predictive maximum yield of ASC on the dry weight basis was 20.97%and experimental value was 20.68%.Comparing predictive value with experimental value，the relative error was 1.38%.The highest relative solubility of ASC from crucian carp scale was obtained at pH4.No changes in solubility were found in the presence of NaCl up to 3%（mg/mL）.However，a sharp decrease but no less than 40%in solubility was observed with NaCl above 3%（mg/mL）.

acid-soluble collagen（ASC）；response surface methodology；optimization；scale

TS254.1

B

1002-0306（2010）11-0247-05

2009-11-25

朱秀靈（1978-），女，碩士，講師，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品資源開發(fā)與利用。

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項目（KJ2009B091）；安徽工程科技學(xué)院青年基金項目（2008YQ050）。