余 梅

（青海普蘭特藥業(yè)有限公司，青海西寧810007）

黃綠蜜環(huán)菌分批發(fā)酵菌絲動力學(xué)模型

余 梅

（青海普蘭特藥業(yè)有限公司，青海西寧810007）

黃綠蜜環(huán)菌，分批發(fā)酵，動力學(xué)模型，擬合

黃綠蜜環(huán)菌［Armillaria luteo-virens（Alb.et Schw. Fr.）Sacc］屬于白蘑科（Tricholomataceae）；蜜環(huán)菌屬（Armillaria），俗稱黃蘑菇，是一種名貴食用菌［1］。主要分布于青海省的海北（祁連、海晏、剛察），黃南（澤庫、河南），海南（共和、貴德、興海），果洛（瑪沁、甘德、久治），玉樹等地。黃綠蜜環(huán)菌子實體肥厚，味道鮮美，營養(yǎng)豐富。干菇中粗蛋白含量高達(dá)39%，此外還含有19種氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)［2-7］。由于黃綠蜜環(huán)菌具有較高的營養(yǎng)價值，尤其是蛋白質(zhì)含量很高，優(yōu)異的活性蛋白使其具有較好的防癌、抗癌、降血糖和提高免疫力的功效?？墒屈S綠蜜環(huán)菌至今不能進(jìn)行人工種植，只能依靠采摘野生菇體滿足日益增長的市場需求，加上青藏高原惡劣的生態(tài)環(huán)境，使得野生資源相當(dāng)貧乏，給采摘工作帶來很大困難。因此采用液體深層發(fā)酵菌絲粉來代替子實體進(jìn)行資源的開發(fā)利用，既不違背對高原珍稀資源保護(hù)的大趨勢，又可以創(chuàng)造高原特色資源開發(fā)的經(jīng)濟價值，還易于實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。為此實驗針對黃綠蜜環(huán)菌在搖瓶培養(yǎng)過程的特性和基本規(guī)律，探討了該菌在70L發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)動力學(xué)，建立了用以描述黃綠蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)菌絲體過程的菌體生長、底物消耗的動力學(xué)模型，并研究了整個發(fā)酵過程各動態(tài)參數(shù)的變化情況，同時得出相關(guān)動力學(xué)曲線，旨在為黃綠蜜環(huán)菌的液體大規(guī)模培養(yǎng)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens Sacc），由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)學(xué)系提供；葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等 分析純；酵母膏購于上海醫(yī)藥集團(tuán)；固體斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，磷酸氫二鉀 1g/L，磷酸二氫鉀 0.5g/L，硫酸鎂0.3g/L，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖34.3g/L，酵母膏1.91g/L，磷酸氫二鉀1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸鎂0.45g/L。

FA1004型電子天平 上海精科天平；HWY-111恒溫培養(yǎng)搖床 上海智城分析儀器制造有限公司、真空冷凍干燥機 美國Svant公司；手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低LXJ -IIB速大容量多管離心機 上海安亭科學(xué)儀器總廠；101-3B型電熱鼓風(fēng)干熱箱 上海市實驗儀器總廠；GUJS7A-70C型發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司；KQ-C型全自控蒸汽發(fā)生器 上海奉賢協(xié)新機電廠；V-0.25型空氣壓縮機 沈陽市達(dá)力壓縮機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化 將黃綠蜜環(huán)菌菌絲塊接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)6d。共活化2次。

1.2.2 種子擴大培養(yǎng) 500mL三角瓶中裝10顆小玻璃珠，干熱殺菌后裝入種子培養(yǎng)基100mL，濕熱滅菌后接種五塊 0.5cm左右的菌塊，在 27±1℃下，200r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)4d左右。

1.2.3 分批發(fā)酵 將液體種子培養(yǎng)基合并后接入70L發(fā)酵罐，接種量為15%，發(fā)酵溫度27±10℃，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，通氣量為1.2L/min，pH由中間取樣后流加堿來控制。

1.2.4 生物量的測定［8］發(fā)酵液在3000r/min的條件下離心20min，將得到的菌絲體多次洗滌，最后至菌絲體于60℃條件下干燥至恒重。

1.2.5 還原糖的測定 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃綠蜜環(huán)菌菌絲發(fā)酵過程代謝變化

菌絲形態(tài)和發(fā)酵過程有關(guān)聯(lián)［10］，結(jié)合菌絲形態(tài)變化與圖1所示的各種代謝指標(biāo)變化情況可以看出，在0～12h發(fā)酵處于延遲期，菌絲球（直徑4mm左右）在剪切力作用下由球狀逐漸變?yōu)榘肭驙?，葡萄糖消耗與菌體濃度增長緩慢；12～36h進(jìn)入對數(shù)期，不規(guī)則的菌絲球碎片逐漸形成大量菌絲體包裹且松散的菌絲小球（直徑2mm左右），殘?zhí)菨舛妊杆傧陆?，菌體生長加速，濃度增加；36～56h處于穩(wěn)定期，菌絲球逐漸變大（直徑3mm左右），且球體密度增大，有些菌體發(fā)生了自溶成為空心球，菌絲生長減速；56h后處于衰亡期，菌絲球密實且多數(shù)出現(xiàn)自溶空心，菌體濃度幾乎沒有變化，因菌體自溶和發(fā)酵液中各種酶的存在，使大量的胞內(nèi)多糖釋放到發(fā)酵液中并迅速被酶降解，發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛扔兴厣?/p>

圖1 黃綠蜜環(huán)菌分批發(fā)酵曲線

2.2 Armillaria luteo-virens Sacc菌體生長動力學(xué)模型

細(xì)胞生長動力學(xué)最常用Monod及Logistic方程描述。Monod［11］方程模型基于以下假設(shè)建立：a.菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長，描述細(xì)胞生長的唯一變量是細(xì)胞的濃度；b.培養(yǎng)基中只有一種基質(zhì)是生長限制性基質(zhì)，其它營養(yǎng)成分過量不影響細(xì)胞生長；c.將微生物生長視為簡單反應(yīng)，菌體得率為常數(shù)，沒有動態(tài)滯后。顯然b、c不符合Armillaria luteo-virens Sacc發(fā)酵的特征，采用 Monod方程有偏差。由于Armillaria luteo-virens Sacc菌絲細(xì)胞生長曲線為 S形，而Logistic［12］模型是一個典型的S型曲線，用于擬合分批發(fā)酵的菌體生長過程具有廣泛的適用性，因此，可應(yīng)用該模型來描述Armillaria luteo-virens Sacc生長動力學(xué)特性。在該方程中將比生長速率與尚未利用的負(fù)載能力相關(guān)聯(lián)，即生長期細(xì)胞的增長速率用式（1）表達(dá)：

式中，μm代表最大細(xì)胞比生長速率，h-1；Xm是基質(zhì)最大負(fù)載的細(xì)胞濃度（g dry cell weight·L-1）；初始條件為t=0時，X=X0，將式（1）積分得：

將式（2）經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后為：

這樣，通過測定X0和μm，可完成上述表達(dá)式。首先應(yīng)用DPS軟件算出不同時間的菌含量、殘?zhí)呛?，然后利用麥夸脫法進(jìn)行迭代確定模型參數(shù)。其模型方程和參數(shù)分別見式（5）和表1。

兩邊取對數(shù)得到速率模型：

模型參數(shù)經(jīng)F檢驗顯著性很高（P＜0.0001），即模型在99%的概率水平上是非常顯著的。t檢驗結(jié)果顯示，3個參數(shù)中X0不是很顯著，只有P=0.287；而最大細(xì)胞生物量Xm最為顯著（P＜0.001），細(xì)胞比生長速率μm比較顯著（P＜0.01）。

圖2為菌體生長模型計算值與實驗值的比較，可以看出，該菌體生長模型在發(fā)酵80h內(nèi)能很好地描述分批發(fā)酵過程的菌體生長情況。在延滯期實驗值要高于擬合值，其原因一方面與菌絲細(xì)胞的可利用率有關(guān)；另一方面因Logistic方程主要反映的是菌體濃度增加和營養(yǎng)物質(zhì)消耗對自身生長的抑制作用，在延滯期和加速生長期，菌體濃度不高，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，對自身生長的抑制作用不明顯，因此擬合情況不如穩(wěn)定期理想。

圖2 黃綠蜜環(huán)菌菌體生長動力學(xué)模型值與實驗數(shù)據(jù)擬合

2.3 Armillaria luteo-virens Sacc底物消耗動力學(xué)模型

在分批發(fā)酵過程中，碳源作為底物，一部分底物用于細(xì)胞生長，一部分合成產(chǎn)物，一部分用于能量消耗以維持細(xì)胞生命之用。其消耗方程可用類似Luedeking-Piret方程［13］來描述。

方程（6）中，γ=1/Yx/s和δ=ms。這兩個參數(shù)可以利用上述方法進(jìn)行計算。在靜止期，細(xì)胞的比生長速率為0，細(xì)胞生物量達(dá)到最大，因此δ可以利用下式進(jìn)行求解。

為了求出γ的值，方程（6）經(jīng)變換得方程：

采用一定的數(shù)值求解法，對方程（8）進(jìn)行變換，得到方程：

其中C（t），D（t）由下式得到：

解方程得到優(yōu)化后的動力學(xué)模型參數(shù)見表1。其消耗動力學(xué)模型見方程（12）。

兩邊取對數(shù)得到速率模型：

表1 動力學(xué)模型參數(shù)估計值

底物消耗的模型值與實驗值的比較結(jié)果見圖3，可以看出二者能很好地吻合，所選模型能夠很好地描述實驗值，這個結(jié)論還可以通過模型參數(shù)的F檢驗結(jié)果和模型的方差檢驗結(jié)果得到驗證（P＜0.0001）。t檢驗分析結(jié)果表明模型系數(shù)為 P= 0.00129，說明該模型在99%水平上差異顯著。

圖3 黃綠蜜環(huán)菌底物消耗動力學(xué)模型與實驗數(shù)據(jù)的擬合

3 討論

菌體增殖動力學(xué)模型在發(fā)酵旺盛期有一個生長高峰，隨后由于菌體的自溶使菌體生物量趨于穩(wěn)定；而底物消耗動力學(xué)模型擬合度誤差主要產(chǎn)生于發(fā)酵初期和后期：發(fā)酵初期，菌體生長較迅速，對糖的消耗較快，測定出發(fā)酵液中的殘?zhí)呛康陀谀Ｐ椭?；發(fā)酵后期，即發(fā)酵60h以后的預(yù)測值與實測值誤差較大，主要原因是菌體分泌產(chǎn)生了大量的胞外多糖以及菌體發(fā)生自溶，多糖在酶作用下被分解，發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛缺葘嶋H值偏高。但是在選取底物消耗動力學(xué)模型時沒有考慮到這一點，若以總糖量來評價底物消耗，可以部分消除這種實驗偏差。由于發(fā)酵體系本身是一個很復(fù)雜的體系，尤其是能產(chǎn)多糖和發(fā)酵后期具有自溶性的食用真菌，不可避免地會導(dǎo)致測定上的偏差，而且發(fā)酵體系本身具有動態(tài)性，很難用一種模型去完全擬合菌體生長的整個階段。鑒于本實驗的目的是獲得較多菌體生物量，因此底物消耗動力學(xué)模型以發(fā)酵60h為基準(zhǔn)（略去其后過程）進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的擬合。

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Kinetic model for mycelium of Armillaria luteo-virens Sacc in batch fermentation

YU Mei
（Qinghai Plateau Pharmaceutial Co.，Ltd.，Xining 810007，China）

Armillaria luteo-virens Sacc；batch fermentation；kinetic model；fit

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0135-03

2009-10-30

余梅（1977-），女，生產(chǎn)部主管，研究方向：制藥及微生物工程。