李 健,李 敏,劉 寧,任惠峰

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.東京海洋大學(xué),東京 108-8477)

萊菔多糖分離純化及相對(duì)分子質(zhì)量初探

李 健1,李 敏1,劉 寧1,任惠峰2

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.東京海洋大學(xué),東京 108-8477)

采用超聲輔助提取萊菔粗多糖 (RP),經(jīng) Sevag法脫除蛋白,苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量。葡聚糖凝膠Sephedex G-100進(jìn)一步分離純化,得到酸性多糖 RP1和 RP2。采用高效凝膠滲透色譜 (HPGPC)對(duì)純化后的兩組分分別進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:多糖含量為 49.1%,RP1、RP2保留時(shí)間幾乎相同,計(jì)算得平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為2.9741×104Da和 3.1038×104Da。

萊菔多糖,分離,純化,平均相對(duì)分子質(zhì)量

萊菔始載于《唐本草》,植物基源于十字花科萊菔屬 (Raphanus L.)植物萊菔 (Raphanus sativus L.)。我國(guó)是中藥的起源之地,而糖類是中藥材中普遍存在的成分,因此對(duì)植物多糖的研究已成為醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域。萊菔作為祖國(guó)傳統(tǒng)資源及藥食同源物質(zhì),具有諸多保健功能,其中部分功能與其多糖組分有關(guān)[1]。因此,研究萊菔多糖的分離純化及相對(duì)分子質(zhì)量等特性,為深入研究和利用萊菔這種我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物資源提供一定的科學(xué)理論依據(jù),并對(duì)新型功能保健食品的開發(fā)和預(yù)防、治療疾病均有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮萊菔 市售;無水乙醇、石油醚、苯酚、濃硫酸、EDTA、NaHCO3、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮 國(guó)產(chǎn)分析純;標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 (Dextran)系列 色譜級(jí),美國(guó)Sigma公司;葡聚糖凝膠 Sephadex G-100,透析袋(MD25:8000～14000)。

數(shù)控超聲波清洗器 (KQ3200DE) 昆山市超聲儀器有限公司;數(shù)控恒溫水浴鍋(W205B)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-205) 上海申勝生物技術(shù)有限公司;萬能粉碎機(jī) 中國(guó)天津泰斯特儀器有限公司;真空干燥箱(DZF-6030A) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;雙光束紫外可見分光光度計(jì) (T U-1901) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;層析柱 (1.6×50cm) 上海錦華層析設(shè)備廠;組合式紫外檢測(cè)儀 (HDL) 上海金達(dá)生化儀器有限公司;自動(dòng)部分收集器 (BSZ-100)上海滬西分析儀器廠有限公司;高效液相色譜(Agilent 1200) 安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萊菔多糖的提取 取市售新鮮萊菔,去表皮污泥、雜質(zhì)后切薄片,于 60℃干燥箱中烘干,粉碎,過40目標(biāo)準(zhǔn)篩,取篩下部分進(jìn)行石油醚浸提脫脂及色素,過夜。真空抽濾,取濾渣超聲輔助提取,真空過濾。濾液減壓濃縮,上清液濃縮為原體積的 1/4～1/5后,加 5倍于其體積的 95%乙醇沉淀多糖。醇沉液體靜置過夜,3000r/min離心 10min,取殘?jiān)婵崭稍?即得萊菔粗多糖粉末。

1.2.2 萊菔多糖的分離純化

1.2.2.1 脫蛋白 采用經(jīng)典 Sevag法脫除蛋白。移取氯仿 40mL,正丁醇 10mL,按照氯仿∶正丁醇 =4∶1的比例配成二元有機(jī)溶劑體系。取適量萊菔粗多糖粉末,復(fù)溶,按多糖∶有機(jī)溶劑 =5∶1的比例添加有機(jī)溶劑體系,充分振搖,并于 4000r/min離心 10min,將離心液轉(zhuǎn)移入梨形漏斗,靜置。溶劑分 3層,上層為多糖水相,下層為有機(jī)溶劑層,中間為變性蛋白層。棄下層有機(jī)溶劑層和變性蛋白層,留上層清液,重復(fù)添加有機(jī)溶劑,直至水層與有機(jī)溶劑層中間無變性蛋白為止。

合并多次脫蛋白液,減壓濃縮,醇沉過夜,離心,沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,少時(shí)得疏松、微黃脫蛋白萊菔多糖。

1.2.2.2 柱層析 Sephadex G-100 將上述一定量的萊菔多糖溶解并定容至刻度,制得 10mg/mL萊菔多糖樣品溶液。取適量葡聚糖凝膠 G-100,常溫下浸泡過夜使之充分溶脹,使用前真空抽濾脫氣。將處理好的葡聚糖凝膠裝柱 (1.6×50cm),洗脫液平衡一夜,上樣 10mg/mL的萊菔多糖溶液 1mL,然后用0.1mol/L的NaCl溶液洗脫,每 15min收集一管,每管收集 2mL。苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖洗脫情況,繪制洗脫峰。紫外檢測(cè)儀跟蹤檢測(cè)有無蛋白吸收。按峰收集洗脫液,濃縮得精制萊菔多糖。

1.2.2.3 透析 透析袋的預(yù)處理:將透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10～20cm)的小段,后用2%(W/V)碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA(pH8.0)將透析袋煮沸 10min,蒸餾水清洗后再用 1mmol/L EDTA(pH8.0)煮沸 10min,冷卻后,加上封蓋 4℃存放待用。透析:將 1.2.2.2過程中所得到的多糖濃縮液分別裝入透析袋內(nèi),放入大燒杯中,流水透析 48h,后用蒸餾水透析 24h[2]。透析過程中,用磁力攪拌器使水流動(dòng),并每隔 3～5h換一次水,以除去多糖溶液中的無機(jī)鹽等小分子化合物。透析液真空冷凍干燥,得萊菔多糖純品。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定[3]

1.2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取 105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 0.5g,溶解并置于 50mL容量瓶中定容至刻度,配成 10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸上述貯備液1mL定容至100mL,配成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。測(cè)定時(shí)吸取 4mL上述標(biāo)準(zhǔn)工作用液定容至 10mL,得 0.04mg/mL的測(cè)定用液。

1.2.3.2 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 取適量配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液,按糖含量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法測(cè)定,以苯酚硫酸為空白,分別在 400～600nm下掃描葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品顯色溶液,以檢測(cè)最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定用液 0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.6mL于 25mL刻度試管中,加蒸餾水定容至 2.0mL,再各加 5%苯酚溶液(取分析純苯酚加沸石少許,加 0.05g碳酸氫鈉,收集182℃的餾分,取 5g定容至 100mL即得)1.0mL,搖勻,迅速加入濃 H2SO4溶液 5mL。振搖 5min,置沸水浴中加熱 15min,取出冷卻 30min,于 490nm以試劑空白為參比測(cè)定吸光度。

1.2.3.4 樣品的測(cè)定 精密稱取脫蛋白粗糖樣品0.05g置于 50mL容量瓶中,溶解并稀釋至刻度,配成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,吸取 4mL上述儲(chǔ)備液定容于10mL容量瓶中,得 0.4mg/mL的待測(cè)用液。吸取1mL,加水定容至 2mL,之后按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定,平行實(shí)驗(yàn) 3次。

1.2.4 萊菔多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

1.2.4.1 多糖樣品的預(yù)處理 分別收集 2個(gè)主峰波峰位置試管內(nèi)溶液,合并多次洗脫液,經(jīng)濃縮、透析后,微孔濾膜(0.45μm)過濾后直接進(jìn)行液相分析。

1.2.4.2 液相色譜分析 (HPLC)條件 液相色譜儀: Agilent 1200;色譜柱:GPC柱;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器(35℃);流動(dòng)相:去離子水;流量:1.0mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.4.3 萊菔多糖相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算 不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖用流動(dòng)相溶解并配制成 10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品,微孔過濾后進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10μL。參考文獻(xiàn)[4]測(cè)定方法,根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)多糖的保留時(shí)間及其相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,多糖的相對(duì)分子質(zhì)量由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到。

1.2.5 多糖理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.5.1 溶解性 取適量脫蛋白萊菔多糖樣品,將其置于不同的溶劑中以檢測(cè)其溶解性。

1.2.5.2 淀粉定性測(cè)定[5]采用碘-碘化鉀法。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫蛋白結(jié)果分析

由圖 1所示,經(jīng) Sevag法脫除蛋白后的萊菔多糖在 260～280nm無明顯紫外吸收,說明脫蛋白后的萊菔多糖不含蛋白、核酸等大分子物質(zhì),與在線蛋白檢測(cè)結(jié)果一致,Sevag法對(duì)萊菔多糖中蛋白脫除效果較好。實(shí)驗(yàn)還研究了不同脫蛋白次數(shù) (3～11次)對(duì)萊菔多糖中蛋白脫除的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,萊菔多糖中蛋白含量較少,萊菔多糖粗品經(jīng)紫外掃描后也沒有明顯的蛋白吸收峰,掃描圖譜見圖 2。說明粗糖干基中蛋白含量較少。故在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,綜合實(shí)驗(yàn)條件以及試劑的節(jié)約等各方面考慮,選取脫除蛋白 5次為宜。

圖 1 萊菔多糖脫蛋白樣品紫外光譜圖

2.2 萊菔多糖的 Sephadex G-100柱層析

按 1.2.2.2實(shí)驗(yàn)方法取 10mg/mL萊菔多糖 1mL上樣,控制流速為 0.133mL/min,收集時(shí)間為 15min,每管收集 2mL多糖,洗脫曲線如圖 3所示。

圖 2 萊菔多糖未脫蛋白樣品紫外光譜圖

圖 3 萊菔多糖的葡聚糖凝膠 Sephadex G-100洗脫曲線

實(shí)驗(yàn)考察了不同收集時(shí)間對(duì)萊菔多糖的分離效果,當(dāng)每管收集時(shí)間為 20min時(shí),多糖洗脫曲線出峰較多,峰形較亂,且其吸光光度值較接近,考慮由于收集時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致不同多糖組分混合,而使分離效果不好,故相應(yīng)縮短每管收集時(shí)間。由圖 3多糖洗脫曲線可以看出,當(dāng)每管收集時(shí)間為 15min時(shí),多糖在該條件下洗脫出峰形較好的 2個(gè)峰,且其為正好完全分開,說明達(dá)到了分離多糖的效果,以每一單一洗脫峰為組分,分別收集管 3～8和管 10～24,且將其分別命名為 RP1和 RP2。繼續(xù)縮短收集時(shí)間,當(dāng)每管收集時(shí)間為 10m in時(shí),同一組分多糖峰分離開來,峰形較散,說明相同組分在較短時(shí)間內(nèi)沒有收集完全。

綜合上述洗脫曲線實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果,確定每管收集時(shí)間選擇為 15min。并在此相同條件下進(jìn)行重復(fù)收集實(shí)驗(yàn),以考察方法的重現(xiàn)性。按以上方法按峰收集洗脫液,并分別放置于冰箱內(nèi)保存。

2.3 萊菔多糖的含量

2.3.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 由圖 4和圖 5比較可知,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品按苯酚--硫酸法顯色后測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)為491nm,同法檢測(cè)萊菔多糖樣品最大吸收峰為 490nm,考慮實(shí)驗(yàn)的方便及方法的準(zhǔn)確性,并綜合其他參考文獻(xiàn)[6-8],最終確定 490nm為實(shí)驗(yàn)用測(cè)定波長(zhǎng)。

圖 4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖

圖 5 萊菔多糖樣品溶液紫外光譜圖

2.3.2 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖 6得到以葡萄糖濃度 C為橫坐標(biāo),吸光光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.0396C+0.0195,R2=0.9923,將 3次平行測(cè)定樣品吸光光度值分別帶入上述回歸方程,得相應(yīng)的不同標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度,按多糖含量計(jì)算公式計(jì)算,取其平均值得脫蛋白多糖含量為 49.1%。

圖 6 萊菔多糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖 7。

圖 7 相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間曲線

2.3.3.2 樣品 HPGPC色譜圖 實(shí)驗(yàn)考察了不同進(jìn)樣量對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品保留時(shí)間的影響,結(jié)果表明,同一樣品進(jìn)樣量與保留時(shí)間成一定的量效關(guān)系,即進(jìn)樣量越大,樣品的保留時(shí)間則較長(zhǎng)。所以,為保證實(shí)驗(yàn)的靈敏度及檢測(cè)的準(zhǔn)確性,在保證正確分析的基礎(chǔ)上應(yīng)該盡量減少進(jìn)樣量,故實(shí)驗(yàn)中所采用的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)樣量皆為 10μL。

根據(jù)圖8,RP1和 RP2的保留時(shí)間分別為8.211min和 8.199min,說明二者可能為同一物質(zhì),或是同分異構(gòu)體,這些還需對(duì) RP1和 RP2的結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步的分析,擬在以后的實(shí)驗(yàn)中,通過氣相色譜、紅外光譜、核磁共振光譜、電鏡以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等各種方法對(duì)萊菔多糖的結(jié)構(gòu)、生理活性等其他性質(zhì)做進(jìn)一步細(xì)致和詳盡的分析,以期為萊菔多糖的結(jié)構(gòu)等方面研究掌握更加全面的理論數(shù)據(jù),相信會(huì)對(duì)萊菔的開發(fā)和研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)踐基礎(chǔ),這些將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中加以完整。實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得二者平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為 2.9741×104Da和3.1038×104Da。

圖 8 RP1、RP2高效凝膠滲透色譜洗脫曲線

2.3.4 萊菔多糖定性 萊菔多糖純品呈白色粉末狀,不易溶于冷水,易溶于熱水。不溶于無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。苯酚--硫酸法反應(yīng)呈橘紅色溶液,說明其含有糖。但由于五碳糖類以及它們的雙糖類均能被硫酸分解成糖醛,六碳糖類以及它們的雙糖類也同樣地被分解成羥甲基糖醛,這些糖醛類化合物均與苯酚作用產(chǎn)生橘紅色縮合產(chǎn)物[5],所以不能說明其為五碳糖還是六碳糖,這些將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過硫酸-咔唑法進(jìn)行鑒定。通過紫外光譜掃描結(jié)果說明,萊菔多糖不含蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究立足于傳統(tǒng)水提醇沉的基礎(chǔ),采用超聲輔助提取萊菔多糖,Sevag法脫除蛋白后,經(jīng)葡聚糖凝膠 Sephadex G-100洗脫得到兩個(gè)主要吸收峰,并分別命名為 RP1和 RP2。二者經(jīng)減壓濃縮、透析、過膜后上葡聚糖凝膠滲透色譜,二者保留時(shí)間幾近相同,說明二者結(jié)構(gòu)可能相似,但并不能得到確定的結(jié)論,還需要輔以其他色譜等結(jié)構(gòu)測(cè)定方法加以說明,這些將會(huì)成為日后的主要研究?jī)?nèi)容。多糖定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,萊菔多糖純品為白色粉末,不溶于冷水、有機(jī)溶劑,易溶于熱水,不含蛋白質(zhì)、核酸、淀粉類物質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于萊菔多糖的研究報(bào)道甚少[1,9],所以本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行對(duì)開發(fā)我國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用植物資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從萊菔多糖的提取到萊菔多糖的分離純化均為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究掌握了第一手理論資料。對(duì)其結(jié)構(gòu)、生物活性等方面的研究將在日后加以補(bǔ)充和完善。

[1]楊萌,熊峰梅,于化泓 .萊菔子多糖的提取及分離純化研究現(xiàn)狀[J].江西食品科技,2007(2):48-50.

[2]朱曉霞,羅學(xué)剛 .多糖提取與純化技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2007,28(3):186-189.

[3]王文平,郭祀遠(yuǎn),李琳,等 .苯酚-硫酸法測(cè)定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科學(xué),2007,28(4):276-279.

[4]李健,劉寧,陳平,等 .香菇多糖分子質(zhì)量的測(cè)定方法研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,21(5):644-648.

[5]劉春蘭,鄧義紅,杜寧,等 .新疆雪蓮水溶性多糖的分離純化及組成分析 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,(20)21: 99-103.

[6]何新益,劉仲華 .苦瓜多糖的改良苯酚-硫酸法測(cè)定和提取工藝[J].食品與機(jī)械,2007,23(4):72-75.

[7]黎晶晶,徐格非 .苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝多糖含量的研究[J].杭州化工,2008,38(1):23-26.

[8]鐘巖,潘浦群,王艷紅,等 .苯酚-硫酸法測(cè)定鮮人參中多糖含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(8):1957-1958.

[9]劉劍利,曹向宇 .蘿卜水溶性多糖的提取工藝研究[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào),2009,36(1).82-84.

Study on isolation purification and relative molecular mass of radish polysaccharids

L I Jian1,L IM in1,L IU Ning1,REN Hui-feng2
(1.Institute of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China; 2.Ocean University of Tokyo,Tokyo 108-8477,Japan)

Us ing ultrasound-ass is ted extrac tion rad ish p olysaccha ride(RP),rem oving of p rote in by Sevag m e thod, p henol-sulfuric ac id m e thod for the de te rm ina tion of the p olysaccha ride content.By Sep hedex G-100for furthe r sep a ra tion and p urifica tion

ac id p olysaccha ridesRP1and RP2.High Pe rform anceGe l Pe rm ea tion Chrom a tog rap hy(HPGPC)ana lyzed comp onent RP1,RP2afte r p urified,resp ec tive ly.The result showed the re tention t im e we re a lm os t sam e of RP1and RP2.Ca lcula ted the ave rage re la tive m olecula r m ass was2.9741× 104Da and3.1038×104Da,resp ec tive ly.

rad ish p olysaccha rides;isola tion;p urifica tion;ave rage re la tive m olecula rm ass

TS201.2

A

1002-0306(2010)01-0151-04

2009-10-26

李健(1956-),男,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:食品化學(xué)。