吳亞涼,寧正祥

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的合成及抗氧化活性的研究

吳亞涼,寧正祥

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

以濃硫酸為溶劑和催化劑,采用直接酯化法合成反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯(VC酯),對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,合成產(chǎn)率可達(dá) 53.45%,并采用羥基自由基體系、超氧陰離子自由基體系、二苯苦味肼基自由基體系對(duì)VC酯、VC的抗氧化活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:在一定的濃度范圍內(nèi),兩者對(duì)·OH、O-2·和 DPPH·均有清除作用,并呈一定的量效關(guān)系。VC酯對(duì)·OH、O-2·和 DPPH·的清除能力均優(yōu)于VC,具有較好的自由基清除作用。

L-抗壞血酸,反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯,合成,抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-抗壞血酸、馬來(lái)酸酐、甲醇、濃硫酸(98%)、乙酸乙酯、30%過(guò)氧化氫、水楊酸、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、Tris、鄰苯三酚、鹽酸 市售,國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?二苯苦味肼基自由基 (DPPH·) Sigma公司,分析純?cè)噭?BHT 食品添加劑。

傅立葉變換紅外光譜儀德國(guó) burker公司;紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(TU-1810PC) 北京普析通用儀器公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (RE-52) 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;分光光度計(jì) (721) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;pH計(jì)(pH-25型) 上海雷磁儀器廠;JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海雷磁儀器廠新涇分廠;恒溫振蕩器(THZ-82) 金壇市富華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富馬酸單甲酯的制備 馬來(lái)酸酐和精確等摩爾量的甲醇在密封環(huán)境中進(jìn)行醇解反應(yīng)生成馬來(lái)酸單甲酯,然后在異構(gòu)化催化劑無(wú)水三氯化鋁存在的情況下異構(gòu)化生成富馬酸單甲酯。按張慶[3]等人的方法,將摩爾比為 1∶1的 19.60g馬來(lái)酸酐和 6.40g甲醇加入裝有冷凝管、攪拌器和溫度計(jì)的 250mL干燥的三口圓底燒瓶中,加熱至 45℃并攪拌至透明,然后升溫至 60℃反應(yīng) 2h。然后加入占體系 4%的氯化鋁,在 80℃條件下異構(gòu)化反應(yīng) 2.5h。用 75℃蒸餾水重結(jié)晶、冷卻、過(guò)濾,于真空干燥箱 55℃時(shí)干燥,得白色固體。

1.2.2 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的合成 采用直接酯化法[4],向 20mL濃硫酸中緩慢加入摩爾比為 1∶3的富馬酸單甲酯(0.015mol)和VC(0.045mol),室溫下攪拌 1h,待 VC完全溶解后,放入恒溫振蕩器中,25～26℃下反應(yīng) 28h。

反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)體系倒入快速攪拌的50g碎冰中,待冰塊完全溶化后,用 50mL乙酸乙酯萃取,分出乙酸乙酯層。水層再用 50mL乙酸乙酯萃取兩次。合并乙酸乙酯層,用無(wú)水 Na2SO4干燥過(guò)夜,在0.1MPa下 33～35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸發(fā)至重量不再改變,得淡黃色物質(zhì)。

合成工藝路線如下:

以目標(biāo)產(chǎn)物的得率為指標(biāo),優(yōu)化影響合成反應(yīng)產(chǎn)率的主要因素 (反應(yīng)物配比、溫度、時(shí)間),并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行紫外及紅外檢測(cè)。

1.2.3 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯清除羥自由基 (·OH)活性研究[5]采用 Fenton反應(yīng)。利用H2O2與 Fe2+混合產(chǎn)生·OH,在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在 510nm處有最大吸收。向試管中依次加入 9mmol/L FeSO40.5mL、9mmol/L水楊酸-乙醇 0.5mL、不同濃度的試樣液4mL,最后加 8.8mmol/L H2O20.5mL啟動(dòng)反應(yīng),37℃反應(yīng) 0.5h,在 510nm下測(cè)量各濃度的吸光度?？紤]到樣品本身的吸光值,以 9mmol/L FeSO40.5mL、9mmol/L水楊酸-乙醇 0.5mL、不同濃度樣品 4mL和0.5mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值?？瞻讓?duì)照不加試樣液,以蒸餾水補(bǔ)充體積。每個(gè)濃度做三個(gè)平行,取其平均值,同時(shí)與 VC、BHT比較清除能力。

式中:AO為空白對(duì)照液的吸光度;AX為加入樣品溶液后的吸光度;AXD為不加顯色劑 H2O2樣品溶液本底的吸光度。

1.2.4 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯清除超氧陰離子(O2-·)活性研究[6]采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定抗氧化性。取 0.05mol/L Tis-HCl緩沖液 (pH= 8.2)4.5mL,置于 25℃水浴中預(yù)熱 20min,分別加入4.4mL各濃度試樣和 0.1mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液(以 10mmol/L HCl配制),混勻后于 25℃水浴中反應(yīng)5min,加 1mL 8mol/L HCl終止反應(yīng),于 299nm處測(cè)定吸光度。對(duì)照管不加鄰苯三酚溶液,測(cè)其試樣的本底吸收值。空白管不加試樣溶液,用 4.4mL蒸餾水補(bǔ)充體積,每個(gè)濃度試樣做三個(gè)平行,取其平均值,同時(shí)與 VC、BHT比較清除能力。

其中:AO、A1、A2分別代表空白、樣品及其對(duì)照的吸光度。

1.2.5 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯清除DPPH·活性研究[7]準(zhǔn)確稱取 20mg DPPH,用無(wú)水乙醇定容于 250mL容量瓶中,得到濃度為 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液,在 0～4℃下避光保存。分別吸取不同濃度的樣品的乙醇溶液 2mL,加入 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL,搖勻后,在室溫,黑暗處放置30min。以無(wú)水乙醇調(diào)零,測(cè)定 517nm處的吸光值A(chǔ)1。同時(shí),測(cè)定樣品溶液 2.0mL與乙醇 2.0mL混合液在 517nm處的吸光值 A2,再測(cè)定 2.0mL DPPH溶液與 2.0mL乙醇在517nm處的吸光值A(chǔ)0。同一測(cè)定重復(fù) 3次,同時(shí)與 VC、BHT比較清除能力。

其中:AO、A1、A2分別代表空白、樣品及其對(duì)照的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物性狀及結(jié)構(gòu)鑒定

產(chǎn)物為淡黃色固體,微溶于水,易溶于乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,不溶于乙醚。

圖 1 富馬酸單甲酯、VC、產(chǎn)物的紫外掃描圖譜

圖1為產(chǎn)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖,曲線1為富馬酸單甲酯的吸收光譜,其在 212nm處有強(qiáng)吸收峰,這是由于富馬酸單甲酯含有碳碳共軛雙鍵,曲線 2為VC的吸收光譜,VC具有環(huán)狀結(jié)構(gòu),在 260nm附近有強(qiáng)吸收,曲線 3為產(chǎn)物的吸收光譜,經(jīng)過(guò)純化過(guò)的產(chǎn)物在這兩波長(zhǎng)附近仍具有強(qiáng)吸收峰,由此初步認(rèn)定為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖 2為產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖,其特征吸收峰如下:酯類的特征吸收峰為位于1715cm-1的 C=O伸縮振動(dòng)吸收帶及 1174cm-1為 -C-O-C-吸收峰; 650cm-1為 =CH的吸收峰,1433cm-1為 CH2與 CH3的變形振動(dòng)吸收蜂,1687cm-1為 C=C的吸收峰, 3084cm-1為產(chǎn)物分子中未參加反應(yīng)的-OH的伸縮振動(dòng)吸收帶。結(jié)合產(chǎn)物的溶解特性,確認(rèn)所得物質(zhì)為產(chǎn)物。

圖 2 產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖

2.2 反應(yīng)條件對(duì)反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯得率的影響

在L-抗壞血酸的四個(gè)羥基中,較易被酯化的是6-位的伯醇羥基,但若反應(yīng)條件控制不當(dāng),L-抗壞血酸的其他的羥基也有可能被酯化,而本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)產(chǎn)物是為L(zhǎng)-抗壞血酸的 6-位有機(jī)酸酯。因此,為了避免副反應(yīng)的發(fā)生,得到高產(chǎn)率的目標(biāo)產(chǎn)物,必須對(duì)反應(yīng)的物料比、溫度及時(shí)間進(jìn)行研究。

2.2.1 物料比對(duì)反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯得率的影響 本反應(yīng)為可逆反應(yīng),增大某一反應(yīng)原料的用量都有利于反應(yīng)向正方向進(jìn)行。VC價(jià)格低廉,所以采用VC過(guò)量。以 98%的硫酸為溶媒,VC與富馬酸單甲酯不同摩爾比,在 25～26℃下,反應(yīng) 28h,考察反應(yīng)收率,結(jié)果如圖 3。

圖 3 物料配比對(duì)VC酯產(chǎn)率的影響

由圖 3可以看出,當(dāng)VC與富馬酸單甲酯的摩爾比在 1.2～2.5范圍內(nèi)時(shí),隨著 VC用量的增加,反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的產(chǎn)率隨之提高,但再提高VC的比例,產(chǎn)率無(wú)明顯提高趨勢(shì),因此,,考慮經(jīng)濟(jì)成本,為了獲得高產(chǎn)率,VC與富馬酸單甲酯的摩爾比為 3較為合適。

2.2.2 反應(yīng)溫度、時(shí)間對(duì)反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯得率的影響 酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng),只有在一定的溫度條件下,才能逾越反應(yīng)的活化能壘,向正方向反應(yīng),得到高產(chǎn)率。反應(yīng)溫度過(guò)低時(shí),底物分子很難逾越反應(yīng)的活化能壘,反應(yīng)緩慢,反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng),酯化產(chǎn)率低。反之,若反應(yīng)溫度過(guò)高,會(huì)造成較多的副反應(yīng),且VC的耐熱性較差,高溫下易氧化,因此反應(yīng)溫度也不能太高。

以 98%的硫酸為溶媒,VC與富馬酸單甲酯的摩爾比為 3,考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響,結(jié)果如圖4。

圖 4 反應(yīng)溫度、時(shí)間對(duì)VC酯產(chǎn)率的影響

由圖 4可以看出,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在 16～28h范圍內(nèi),各溫度下的酯化產(chǎn)率均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 28h,各溫度的酯化產(chǎn)率均為最高,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從 28 h增加到 40h,產(chǎn)率下降,且產(chǎn)物的色澤變差。因此,反應(yīng)的最佳時(shí)間為 28h。

溫度不宜太過(guò)高也不宜太低,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為28h,反應(yīng)溫度為 25℃時(shí),酯化產(chǎn)率達(dá)到最高,為53.45%;當(dāng)反應(yīng)溫度高于 25℃,反應(yīng)的選擇性會(huì)降低,生成顯著量的 5-位酯和 5,6-位二酯等副產(chǎn)物。此外,過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致 VC被氧化,造成較多的副反應(yīng),使產(chǎn)率降低,且濃硫酸的炭化作用使產(chǎn)品色澤變差。因此,反應(yīng)的最佳溫度為 25℃。

2.3 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯抗氧化活性的研究

2.3.1 清除羥自由基(·OH)活性研究 根據(jù) Fenton方法產(chǎn)生·OH自由基的模型[8],H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH自由基,該反應(yīng)為:H2O2+Fe2+→OH-+·OH+Fe3+,自由基一般存活時(shí)間比較短而且具有較高活性,而水楊酸能有效地捕捉·OH自由基且產(chǎn)生有色產(chǎn)物,該有色物質(zhì)在 510nm處有最大的吸收,若向體系中加入自由基清除基,體系在最大吸收波長(zhǎng)處吸收減弱,由此可以測(cè)算所加入的物質(zhì)對(duì)自由基的清除率。I C50值表示清除 50%自由基時(shí)所需抗氧化劑的量,是衡量其抗氧化效果的有效指標(biāo)。

由圖 5可見(jiàn),隨著各試樣液濃度的增加,各試樣對(duì)羥基自由基的清除能力均呈上升趨勢(shì),清除率與濃度成量效關(guān)系。清除能力大小依次為:VC酯 > BHT>VC。VC酯、BHT、VC清除·OH的 I C50值分別為 0.14、0.17、0.31mg/mL。

由圖 6可以看出,在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi),VC酯、BHT、VC清除·的 I C50值分別為 0.21、0.24、 0 1 2 9 m g／m L，且清除率隨著濃度的增大而增大。特別是當(dāng)VC酯的質(zhì)量濃度達(dá)到 0.11mg/mL后,其清除·能力優(yōu)于 BHT。這說(shuō)明,VC酯對(duì)·有良好的清除作用。

圖5 VC、VC酯、BHT對(duì)·OH的清除能力

圖 6 VC、VC酯、BHT對(duì)O-2·的清除能力

2.3.3 清除 DPPH·活性研究 二苯苦味肼基(DPPH·)是一種穩(wěn)定的自由基,其乙醇溶液呈深紫色,在可見(jiàn)光區(qū) 517nm處有最大吸收峰。當(dāng)向含有DPPH·的溶液體系加入自由基清除劑時(shí),其中的孤電子被配對(duì)形成另一穩(wěn)定的化合物,溶液顏色由深變淺,反應(yīng)體系在 517nm處的吸光度值將變小,吸光度值變小的程度與自由基被清除程度呈定量關(guān)系[9],據(jù)此可檢測(cè)自由基被消除的情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 7所示。

圖 7 VC、VC酯、BHT對(duì)DPPH·的清除能力

由圖7可見(jiàn),各試樣對(duì)自由基均具有清除DPPH·作用,清除能力大小依次為:VC酯 >BHT>VC。各試樣在一定濃度范圍內(nèi),清除能力與濃度成量效關(guān)系,且各試樣均表現(xiàn)了相似的變化趨勢(shì),即達(dá)到最大清除率后,清除率將不再隨濃度的增加而增強(qiáng)。VC酯、BHT、VC清 除 DPPH·的 I C50值分別為 0.20、0.30、0.49mg/mL。

3 結(jié)論

3.1 采用直接酯化法,以 L-抗壞血酸、馬來(lái)酸酐為原料,濃硫酸作為催化劑及溶劑,合成反丁烯二酸-6 -L-抗壞血酸甲酯。其最優(yōu)反應(yīng)條件為 VC與富馬酸單甲酯的摩爾比為 3,反應(yīng)溫度為 25℃,反應(yīng)時(shí)間為 28h,在此反應(yīng)條件下,產(chǎn)率高達(dá) 53.45%。

3.2 反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯的抗氧化性能表明,其對(duì)·OH、O-2·和DPPH·均具有良好的清除作用,在一定濃度范圍內(nèi),其清除效果與 VC酯濃度成正相關(guān),且其清除效果優(yōu)于VC,清除·OH、O-2·和DPPH·的 I C50值分別為 0.14、0.21、0.20mg/mL,是一種良好的抗氧化劑。本文通過(guò)對(duì) VC進(jìn)行化學(xué)改性,擴(kuò)展了其在應(yīng)用過(guò)程的穩(wěn)定性,為開(kāi)發(fā)新的VC衍生物提供了依據(jù)。

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Synthesis of 6-L-ascorbyl trans-β-alkoxycarbonylacrylate and study on its antioxidant property

W U Ya-liang,NING Zheng-xiang
(College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te was p rep a red via es te rifica tion by H2SO4as the solvent and ca ta lys.The reac tion cond itions was op t im ized and 53.45% yie ld could be ob ta ined unde r the op t im um synthes is cond ition.The antioxida tive ac tivities of ascorb ic ac id and6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te was comp a red through the sup e roxide anion free rad ica l sys tem,hyd roxyl rad ica l sys tem and sys tem ofDPPH·. D iffe rent scaveng ing effec t be tween ascorb ic ac id and6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te in these rad ica lsys tem s wasobse rved,bes ides the antioxide tive ac tivitiesbecom e s tronge r w ith the inc rease of the concentra tion.The scaveng ing cap ab ility of6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te to sup e roxide anion free rad ica l,hyd roxyl rad ica l and DPPH· wass tronge r than tha t of ascorb ic ac id.6-L-ascorbyl trans-βa lkoxyca rbonylac ryla te was found w ith s ignificant scaveng ing effec t.

ascorb ic ac id;6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te;synthes is;antioxidant ac tivity

TS202.3

A

1002-0306(2010)01-0310-04

L-抗壞血酸是一種水溶性的維生素,也是一種維持人體正常生理活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,同時(shí)還作為一種安全高效的抗氧化劑廣泛用于食品工業(yè),然而 L-抗壞血酸有穩(wěn)定性不佳、脂溶性較差等缺點(diǎn)。由于VC分子中有烯二醇基團(tuán),具有較強(qiáng)的還原能力,因此極易被氧化為去氫抗壞血酸,尤其是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下,VC的功效極易減弱甚至消失[1]。VC的不穩(wěn)定性使其應(yīng)用受到限制,因此,對(duì)VC進(jìn)行改性,增強(qiáng)其穩(wěn)定性進(jìn)而擴(kuò)展其應(yīng)用范圍,是目前世界上許多公司和學(xué)者所關(guān)注的熱點(diǎn)。目前已被開(kāi)發(fā)的抗壞血酸及其衍生物主要有抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、異抗壞血酸及其鈉鹽、抗壞血酸棕櫚酸酯和抗壞血酸硬脂酸酯等[2],主要被德國(guó)巴斯夫公司、日本武田公司、SIG MA公司等幾家大公司所壟斷。本實(shí)驗(yàn)以 L-抗壞血酸和馬來(lái)酸酐為主要原料,濃硫酸為溶劑及催化劑,采用直接酯化法對(duì)L-抗壞血酸進(jìn)行分子修飾,對(duì)其反應(yīng)條件 (如物料配比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度)進(jìn)行優(yōu)化,合成了一種新的 VC衍生物——反丁烯二酸-6-L-抗壞血酸甲酯,提高了 VC的穩(wěn)定性,并對(duì)其對(duì)·OH、O-2·和DPPH·自由基的清除能力進(jìn)行研究。

2009-03-30

吳亞涼(1985-),女,碩士,研究方向:食品化學(xué)。