邵佩霞

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

蔗糖對(duì)酶法改性甜菊糖的影響研究

邵佩霞

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

用節(jié)桿菌產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶催化轉(zhuǎn)果糖基作用,對(duì)甜菊糖進(jìn)行分子改性。采用蔗糖和甜菊糖的混合反應(yīng)體系,考察了不同濃度蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響,并比較了間歇式補(bǔ)加固體蔗糖和連續(xù)流加蔗糖溶液對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響,對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化條件下,采用初始濃度為 20%(W/V)的蔗糖反應(yīng),反應(yīng)過程流加 30%(W/V)蔗糖溶液,反應(yīng) 5h后,甜菊雙糖A苷和甜菊苷的轉(zhuǎn)化率均超過 90%,反應(yīng)過程中二者的最高轉(zhuǎn)化率均可達(dá) 98.6%。

甜菊糖,蔗糖,β-呋喃果糖苷酶,改性

圖1 St、RA的結(jié)構(gòu)及組成

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-呋喃果糖苷酶 利用節(jié)桿菌在適宜的培養(yǎng)條件下自制;甜菊糖 黑龍江省海林農(nóng)場(chǎng)甜菊糖甙廠,含 RA28%,St55%;蔗糖 廣州化學(xué)試劑廠,分析純;葡萄糖 上海伯奧生物科技有限公司,分析純;乙腈D IMA TECHNOLOGY INC.,色譜純。

UV-2100紫外可見分光光度計(jì) 廣州市正一科技有限公司;BT100-1J型蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司;恒溫氣浴搖床 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;高效液相色譜儀 Waters,美國。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶活力的測(cè)定 用磷酸鹽緩沖液(50mmol/L,pH6.5)配制濃度為 25%(W/V)的蔗糖溶液。取蔗糖溶液 2mL,置于 40℃恒溫水浴中保溫 10min,然后加入β-呋喃果糖苷酶粉 0.01g,置于40℃搖床 200r/min下反應(yīng) 20min,然后將樣品置于100℃水中 10min以終止反應(yīng)。樣品通過 0.22μm微孔濾膜過濾后,用高效液相色譜 (HPLC)檢測(cè)各組分,外標(biāo)法計(jì)算葡萄糖的含量。一個(gè)酶活力單位定義為：在上述條件下每分鐘產(chǎn)生 1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.2.2 甜菊糖的酶法改性研究

1.2.2.1 不同摩爾濃度蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響

用磷酸鹽緩沖液(50mmol/L,pH6.5)分別配制不同摩爾濃度的蔗糖與 1%(w/v)甜菊糖混合液,反應(yīng)液體積為 200mL,加入 FFase 15U/mL,置于 35℃搖床200r/min下反應(yīng)。不同時(shí)間取樣,樣品置于 100℃水中 10min以終止反應(yīng),考察不同濃度蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.2.2 間歇式補(bǔ)加固體蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響 設(shè)計(jì)3因素4水平的正交實(shí)驗(yàn),考察在反應(yīng)過程中間歇式補(bǔ)加固體蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響。反應(yīng) 3h后第一次補(bǔ)加,5h后第二次補(bǔ)加,7h后第三次補(bǔ)加,9h后第四次補(bǔ)加。反應(yīng)條件同 1.2.2.1,實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.2.2.3 連續(xù)流加蔗糖溶液對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響用磷酸鹽緩沖液 (50mmol/L,pH6.5)配制 20% (w/v)蔗糖與 1%(w/v)甜菊糖混合液,反應(yīng)液初始體積為 50mL,加入 FFase 150U/mL。反應(yīng)過程中分別向反應(yīng)體系流加 20%～50%(w/v)蔗糖溶液 50mL/h,其余反應(yīng)條件同 1.2.2.1,考察連續(xù)流加蔗糖溶液對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.3 酶法改性甜菊糖的色譜分析條件 樣品通過0.22μm微孔濾膜過濾后,用 HPLC檢測(cè)改性結(jié)果,用峰面積歸一化法計(jì)算甜菊糖的轉(zhuǎn)化率。色譜系統(tǒng)：Separations Module(Waters 2695),Photodiode Array Detector(Waters 2998);色譜柱：SunFireTMC18φ5μm, 4.6×250mm;梯度洗脫：流動(dòng)相為乙腈-水 (28∶72)至乙腈-水 (47∶53),流速 0.8mL/min,洗脫時(shí)間 20min;檢測(cè)波長 213nm,檢測(cè)器溫度 30℃,柱溫 30℃,進(jìn)樣體積10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法改性甜菊糖的 HPLC測(cè)定

按 1.2.3所述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)產(chǎn)物 RA-F、St-F和反應(yīng)物 RA、St進(jìn)行分析,結(jié)果如圖 2所示。

圖2 酶法改性甜菊糖的HPLC圖

由圖 2可知,采用梯度洗脫對(duì)反應(yīng)液物質(zhì)進(jìn)行分離,與等度洗脫相比大大縮短了分離時(shí)間,在此條件下各反應(yīng)底物及產(chǎn)物均達(dá)到良好的分離效果,是一種高效靈敏的分離檢測(cè)方法。

2.2 不同摩爾濃度蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響

在蔗糖為底物的酶催化體系中,蔗糖在低濃度(5～20g/L)時(shí),FFase催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖并生成極少量的低聚果糖,主要表現(xiàn)為水解活力;在高濃度 (200～700g/L)時(shí),產(chǎn)物主要為低聚果糖,主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移活力;蔗糖濃度處于 5～20g/L和 200～700g/L之間時(shí),FFase呈現(xiàn)出兩種酶活[5-8]。底物蔗糖濃度對(duì) FFase的酶活有重要影響,在甜菊糖的酶法改性中,主要利用 FFase的轉(zhuǎn)移活力,因此本研究考察了 RA和 St在 0.25～2mol/L濃度蔗糖中的轉(zhuǎn)化率,以確定甜菊糖酶法改性的較優(yōu)條件,結(jié)果如圖 3所示。

圖3 蔗糖濃度對(duì)RA和 St轉(zhuǎn)化率的影響

由圖 3可看出,蔗糖濃度對(duì) RA和 St的轉(zhuǎn)化率有顯著影響,RA和 St轉(zhuǎn)化率的變化趨勢(shì)非常相似。蔗糖濃度在 0.25mol/L時(shí),RA和 St的轉(zhuǎn)化率很低且變化緩慢,反應(yīng) 5h后轉(zhuǎn)化率基本不再增長,最高轉(zhuǎn)化率分別是 43.4%和 46.1%。原因是蔗糖濃度較低時(shí),FFase主要表現(xiàn)為水解活力,抑制了 FFase催化的轉(zhuǎn)果糖基作用,RA-F和 St-F的生成率大大降低。蔗糖濃度在 0.5～1mol/L時(shí),在反應(yīng) 5h前,RA和 St的轉(zhuǎn)化率增長迅速,此范圍內(nèi)的蔗糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響不大;反應(yīng) 5h后,RA和 St的轉(zhuǎn)化率增長緩慢,且隨著時(shí)間的延長,轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)一定程度的下降。原因是蔗糖在反應(yīng)過程中不斷被消耗,蔗糖濃度隨之下降,FFase催化的水解作用使轉(zhuǎn)移的果糖基從產(chǎn)物上脫落,導(dǎo)致產(chǎn)物量下降。蔗糖濃度在 1.5～2mol/L時(shí),RA和 St的轉(zhuǎn)化率持續(xù)增長,但增長緩慢,反應(yīng)20h后轉(zhuǎn)化率均達(dá)到 65%左右;而蔗糖濃度在0.75～1mol/L時(shí),反應(yīng) 7～9h后 RA和 St的轉(zhuǎn)化率即可達(dá)到 65%左右。原因是 FFase的最佳反應(yīng)溫度在30～40℃,本研究采用 35℃,在此溫度條件下,高濃度蔗糖使反應(yīng)液變得很粘稠,反應(yīng)傳質(zhì)能力大大降低,反應(yīng)速率下降。因此,綜合考慮,選取最佳的蔗糖濃度為 0.5～1mol/L,即 17.1%(w/v)～34.2%(w/v),為方便起見,蔗糖濃度用質(zhì)量-體積百分濃度表示,下同。

表2 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

2.3 間歇式補(bǔ)加固體蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響

隨著反應(yīng)過程中底物蔗糖的消耗,甜菊糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高點(diǎn)后由于水解作用開始緩慢下降,補(bǔ)加蔗糖可以繼續(xù)提高甜菊糖的轉(zhuǎn)化率。本研究通過蔗糖初始濃度、蔗糖補(bǔ)加量、蔗糖補(bǔ)加次數(shù)的 3因素4水平正交實(shí)驗(yàn),考察反應(yīng) 20h后 RA和 St的轉(zhuǎn)化率,探索通過補(bǔ)加蔗糖提高甜菊糖轉(zhuǎn)化率的優(yōu)化條件,結(jié)果如表 2所示。

由表 2可見,各列極差范圍為 5.712～7.672,極差大小差別不大,可見各因素對(duì)甜菊糖的轉(zhuǎn)化率都有一定影響且影響程度相當(dāng)。根據(jù)直觀分析,實(shí)驗(yàn)的理論最佳條件應(yīng)為蔗糖初始濃度 30%、補(bǔ)加量0.15g/mL、補(bǔ)加次數(shù) 3次,此條件在正交表中并未出現(xiàn),因此采用此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到 RA和 St的轉(zhuǎn)化率分別為 73.10%和 75.81%。而正交表實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的條件為蔗糖初始濃度 20%、補(bǔ)加量 0.2g/mL、補(bǔ)加次數(shù)3次,此條件下反應(yīng)20h后RA和 St的轉(zhuǎn)化率分別為 73.80%和 76.18%,與理論最佳條件下的轉(zhuǎn)化率相當(dāng),因此需要從降低底物成本和提高轉(zhuǎn)化率綜合考慮以確定最優(yōu)條件。優(yōu)化條件后 RA和 St的轉(zhuǎn)化率比實(shí)驗(yàn) 1.2.2中的最高轉(zhuǎn)化率提高了 10%左右,得到了較滿意的結(jié)果。

2.4 連續(xù)流加蔗糖溶液對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響

在實(shí)驗(yàn) 1.2.3中,蔗糖以固體的形式補(bǔ)加,補(bǔ)加后蔗糖需要一定時(shí)間才能溶解并參與反應(yīng),又由于間歇式補(bǔ)加會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系不均勻而延緩甜菊糖的轉(zhuǎn)化,因此轉(zhuǎn)化率沒有大幅上升。為探索繼續(xù)提高甜菊糖轉(zhuǎn)化率的方法,采用初始濃度為 20%的蔗糖反應(yīng),反應(yīng)過程分別流加 20%～50%的蔗糖溶液,并與不流加蔗糖的情況進(jìn)行比較。由于流加溶液過程中,反應(yīng)體系的增大會(huì)導(dǎo)致酶濃度下降而降低反應(yīng)速率,為縮短反應(yīng)時(shí)間,該實(shí)驗(yàn)中初始酶濃度從實(shí)驗(yàn)1.2.2、1.2.3的 15U/mL增加至 150U/mL,探索此條件下甜菊糖轉(zhuǎn)化率的變化,結(jié)果如圖 4所示。

圖 4 連續(xù)流加蔗糖溶液對(duì)RA和 St轉(zhuǎn)化率的影響

由圖 4可看出,不流加蔗糖溶液的情況下,由于反應(yīng)過程中底物蔗糖不斷被消耗導(dǎo)致蔗糖濃度下降,反應(yīng)體系在低蔗糖濃度時(shí)的水解作用加劇,因此RA-F和 St-F的生成量急劇下降,反應(yīng) 24h后 RA和 St的轉(zhuǎn)化率分別只有 10.7%和 10.8%。而流加蔗糖溶液可顯著提高甜菊糖的轉(zhuǎn)化率,流加蔗糖濃度為 20%時(shí),反應(yīng) 12h后 RA和 St的轉(zhuǎn)化率分別為88.4%和 90.9%,隨著時(shí)間的延長,反應(yīng)達(dá)到平衡,轉(zhuǎn)化率變化不大。流加蔗糖濃度為 30%～50%時(shí),在反應(yīng)初期 (2h前),RA和 St的轉(zhuǎn)化率隨著流加濃度的增大而呈小幅下降;反應(yīng)中后期,各流加濃度條件下的甜菊糖轉(zhuǎn)化率極為接近,可見此時(shí)該范圍內(nèi)的流加蔗糖濃度對(duì) RA和 St的轉(zhuǎn)化率影響不大,反應(yīng) 5h后,RA和 St的轉(zhuǎn)化率均超過 90%,反應(yīng)過程中 RA和 St的最高轉(zhuǎn)化率均可達(dá) 98.6%。流加蔗糖反應(yīng)液在常溫下放置一周,RA和 St的轉(zhuǎn)化率基本保持不變,反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定。綜合考慮,采用初始濃度為 20%的蔗糖反應(yīng),反應(yīng)過程中流加 30%的蔗糖溶液可大幅提高甜菊糖的轉(zhuǎn)化率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。

3 結(jié)論

在磷酸鹽緩沖液體系中,利用節(jié)桿菌產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖與蔗糖進(jìn)行轉(zhuǎn)果糖基反應(yīng),對(duì)甜菊糖進(jìn)行改性。主要通過考察底物蔗糖對(duì)甜菊糖改性的影響,考察了不同濃度蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響,并比較了間歇式補(bǔ)加固體蔗糖和連續(xù)流加蔗糖溶液對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響,對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。最后采用初始濃度為 20%的蔗糖反應(yīng),反應(yīng)過程流加 30%蔗糖溶液的方法,反應(yīng) 5h后,RA和St的轉(zhuǎn)化率均超過 90%,反應(yīng)過程中 RA和 St的最高轉(zhuǎn)化率均可達(dá) 98.6%。反應(yīng)液在常溫下放置一周,反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定。甜菊糖作為新型甜味劑具有優(yōu)良的性質(zhì)和巨大的開發(fā)價(jià)值,以上研究探討了酶法轉(zhuǎn)果糖基作用改性甜菊糖,顯著提高了甜菊糖的轉(zhuǎn)化率,為去除其后苦味提供了理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。

[1]徐仲偉,邵佩霞,陳華勇,等 .β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖的改性研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(11)：1108-1110.

[2]Hanson J R,de Oliveira B H.Stevioside and related s weet diterpenoid glycosides[J].Nat Prod Rep,1993,10：301-309.

[3]Geuns J M C.Stevioside[J].Phytochemistry,2003,64：913-921.

[4]Ishikawa H,Kitahata S,Ohtani K,et al.Production of stevioside and rubusoside derivatives by transfructosylation of beta -fructofuranosidase[J].Agric Biol Chem,1990,54：3137-3143.

[5]Min Hong K im,Man JinIn,Hyung Joon Cha,et al.An empirical rate equation for the fructooligosaccharide-producing reaction catalyzed byβ-Fructofuranosidase[J].Journal of Fermentation And Bioengineering,1996,82(5)：458-463.

[6]Byung Woo Kim,Jang Won Choi,Jong Won Yun.Selective production of GF4-fructooligosaccharide from sucrose by a new transfructosylating enzyme[J].Biotechnology Letters,1998,20 (11)：1031-1034.

[7]Rubén Cuervo Fernández,Beatriz Guilarte Maresma,Antonio Juárez,etal.Production offructooligosaccharides byβ -fructofuranosidase fromAspergillus sp27H[J].JournalofChemical Technology and Biotechnology,2004,79：268-272.

[8]曹勁松 .蔗果糖酶的研究[D].華南理工大學(xué),1997.

Effect of sucrose on steviosides by enzym atic modification

SHAO Pei-xia
(College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

A rthrobac te r p roduc ingβ-fruc tofuranos idase was used form olecula rm od ifica tion of s tevios ides.Suc rose and s tevios ides m ixed reac tion sys tem was used and the reac tion cond itions we re op t im ized.In the op t im ized cond itions,we used the initia l concentra tion of20%(W/V)suc rose and continuous ly added30%(W/V)suc rose solution in the reac tion p rocess.The conve rs ion of rebaud ios ide A and s tevios ide was both ove r90%afte r5h,and the ir highes t conve rs ion was both98.6% in the reac tion p rocess.

s tevios ides;suc rose;β-fruc tofuranos idase;m olecula rm od ifica tion

TS201.2+3

A

1002-0306(2010)03-0187-04

甜菊糖甙簡稱甜菊糖 (Steviosides),是從菊科植物甜葉菊 (S tevia rebaudianaBertoni)葉中提取的高甜度、低熱量的天然甜味劑,其甜度相當(dāng)于蔗糖的200～350倍,熱量是蔗糖的 1/200～1/300。其除了具有高甜度、低熱量的特性外,還有一定藥理作用,對(duì)糖尿病、肥胖癥、心臟病和高血壓有明顯的藥理作用和輔助療效。甜菊糖是一種安全的食品甜味劑,已經(jīng)被 FDA批準(zhǔn)使用,國內(nèi)外大量毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,甜菊糖無致畸、致突變、致癌性,是目前國內(nèi)外公認(rèn)的可替代蔗糖的理想的健康新糖源,是繼甘蔗糖、甜菜糖之外第三種具有開發(fā)價(jià)值的天然甜味劑,被譽(yù)為“世界第三糖源”[1]。甜菊糖是 8種不同甜味成分的雙萜糖苷混合物,其中兩種主要成分甜菊苷(Stevioside,簡稱 St)和甜菊雙糖 A苷 (Rebaudioside A,簡稱 RA)共占甜菊糖的 80%以上。二者均有一定的苦味和不愉快的后味,二者的結(jié)構(gòu)式及組成見圖 1[2-3]。這種后味及苦味限制了其更為廣泛的工業(yè)應(yīng)用。酶法技術(shù)改性甜菊糖是當(dāng)今甜菊糖后苦味改善和脫除最快捷、最有效的方法。通過酶法改性在St和 RA中引入果糖基,果糖基以β-2,6糖苷鍵連接至 19-O-β-葡萄糖基的 6-OH上[4],得到的衍生物 St-F和 RA-F的甜味特性有較大改善。β-呋喃果糖苷酶(FFase,EC 3.2.1.26)不僅可以從各種β-D-呋喃果糖苷底物的非還原端釋放β-果糖,還能用蔗糖作果糖基供體將果糖基轉(zhuǎn)移給含有羥基的受體[5]。因此,FFase同時(shí)具有水解活力和轉(zhuǎn)移活力,不同來源的 FFase對(duì)不同濃度蔗糖的兩種酶活分布有所區(qū)別。本研究以蔗糖和甜菊糖為反應(yīng)底物,利用節(jié)桿菌產(chǎn) FFase催化的轉(zhuǎn)果糖基作用對(duì)甜菊糖進(jìn)行分子改性,主要探討底物蔗糖對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化率的影響。

2009-04-21

邵佩霞(1985-),女,碩士研究生,研究方向：食品生物技術(shù)。