李小華,于 新,畢 陽 (.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東廣州 50225)

非洲山毛豆種子蛋白質(zhì)組分分析

李小華1,2,于 新2,＊,畢 陽1(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東廣州 510225)

以山毛豆種子為原料,對其蛋白質(zhì)進行分級分離,測定了各組分蛋白含量、等電點和溶解度。結果表明,脫脂山毛豆粉的總蛋白含量為 47.11%(m/m)。其中,清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相對百分含量分別為 64.04%、8.83%、11.06%和 14.50%,另外含有 1.57%難溶的復合蛋白。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的等電點為 pH 4.3、pH5.1和pH 4.7,谷蛋白的等電點為 3.5～3.8。它們在等電點附近溶解度較小,偏離等電點之后即 pH＞5或 pH＜4清蛋白和球蛋白的溶解度增大,而醇溶蛋白和谷蛋白的溶解度增加較小。SDS-PAGE電泳表明,非洲山毛豆種子總蛋白的相對分子量差異較大,在 20.1～97.2kDa及小于 20.1kDa的均有分布,但其譜帶分布不明顯。清蛋白譜帶變化范圍為主要有 6條,變化區(qū)域集中在 20.1～66.4kDa及小于 20.1kDa的范圍。球蛋白在 20.1～66.4kDa大約出現(xiàn)了 10條譜帶。醇溶蛋白在 20.1、29.0、44.3kDa分別有3條明顯的譜帶。谷蛋白在 20.1～97.2kDa大約有 10條以上的譜帶,說明非洲山毛豆種子總蛋白及各組分蛋白均有不同的分子組成。

山毛豆種子,蛋白質(zhì)組成,等電點,溶解性,SDS-PAGE電泳

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非洲山毛豆種子 2008年 1月 20日采自廣州市花都區(qū)北興鎮(zhèn)山坡(北緯 23°27’,東經(jīng) 113°26’),通過索氏抽提油脂得到山毛豆粕(粉末)。

電子天平 德國 Sartorial公司;島津 UV-2550紫外可見分光光度計 島津蘇州工廠;M ini-PROTEAN4電泳儀 美國B IO-RAD公司;TGL-16C型臺式離心機 上海安寧科學儀器廠;PHS-25型酸度計 上海偉業(yè)儀器廠;85-2型恒溫磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司;G-9140A型電熱恒溫干燥箱 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠;SD-1500噴霧干燥機 上海沃迪科技有限公司;LGJ-12冷凍干燥機北京松源華興科技發(fā)展有限公司;凱氏定氮裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙縮脲試劑的配制 將 10mol/L氫氧化鉀10mL和 25%酒石酸鉀鈉溶液 20mL加入到 930mL蒸餾水中,劇烈攪拌,同時慢慢加入 4%硫酸銅溶液40mL,以免生成氫氧化銅沉淀[7]。

1.2.2 蛋白質(zhì)組分的分級分離 稱取一定量的脫脂山毛豆粉,置于燒杯中,按豆粉和水比例為 1∶10(m/v)加入去離子水,在室溫下強力攪拌 1h,離心,得到的上清液為清蛋白組分。向燒杯中的殘渣中加入 10% (m/m)的NaCl溶液(與上述去離子水等體積),室溫下攪拌 1h,離心,得到的上清液為球蛋白組分。向上述鹽溶液提取后的殘留物中加 75%乙醇(與上述去離子水等體積),用玻棒攪拌,將混合液置于 80℃的水浴中 5min,在此期間不停攪拌。其后取出燒杯,繼續(xù)攪拌 5min,離心 (4000r/min,10min),收集上清液,即為谷蛋白組分。向上述乙醇溶液提取后的殘留物中加入 0.2%的 NaOH溶液 (與上述去離子水等體積),攪拌 15min,離心 (4000r/min,10min),收集上清液,作為谷蛋白待測分析[8]。

1.2.3 山毛豆清蛋白和球蛋白的制備

1.2.3.1 清蛋白制備 清蛋白提取液經(jīng)噴霧干燥得粉狀清蛋白制備物。

1.2.3.2 球蛋白制備 球蛋白提取液經(jīng)蒸餾水透析72h后,離心收集沉淀,凍干備用。

1.2.3.3 球蛋白和醇溶蛋白的制備 各組分提取液對蒸餾水透析 72h后,離心收集沉淀,凍干備用。

1.2.3.4 谷蛋白組分的制備 谷蛋白提取液用2mol/L HCl調(diào) pH至 4.5,離心收集沉淀,水洗 3次,凍干備用。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定 微量凱氏定氮法[7]。

1.2.5 等電點測定

1.2.5.1 等電點范圍的預實驗 稱取 5.00g組分蛋白溶于 500mL去離子水,得到 1.00%樣品提取液,分別取 1%樣品提取液 10mL于 5支標有管號和管種的20mL離心管中,分別依次調(diào) pH為 2、3、4、5、6,然后在離心機上以 3000r/min離心 15min后,小心倒去清液,烘干一定程度,稱其沉淀質(zhì)量。

1.2.5.2 雙縮脲法測等電點 將各組分蛋白分別用去離子水配制成 0.5%、1%和 2%的樣品液。分別取樣品液 10mL于 50mL比色管中,分別依次調(diào) pH為等電點周圍 7～9個點,然后在離心機上以 3000r/min離心 15min后,小心收集上清液,用雙縮脲法測吸光度值。分別依次取 10mL上清液于對應號數(shù)的 25mL容量瓶,加 0.5mL四氯化碳,用雙縮脲試劑定容至刻度。靜置 1h后,取上清液 12mL離心,取離心分離后透明液于比色皿中,在 560nm下測定吸光值[9]。

1.2.6 溶解性實驗[5]樣品的溶解性用氮溶解指數(shù)(NSI)來評價。分別用去離子水配制 1%(m/v)蛋白樣品溶液 8mL,用 0.05mol/L HCl或 0.05mol/L NaOH溶液調(diào) pH至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,磁力攪拌120min,離心 15min,采用凱氏定氮法測定上清液中的蛋白含量。

1.2.7 SDS-PAGE電泳分析 參照 Lemion的方法[10]進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠濃度為10.0%,濃縮膠濃度 4%,每管點樣 20μL,在 15mA恒壓電泳 45min,用考馬斯亮藍染色 30min,用脫色液脫色至背景無色,拍照保留。標準分子量購于寶生物工程有限公司。

2 結果與分析

2.1 山毛豆蛋白質(zhì)組分測定

根據(jù)蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度不同的性質(zhì),可以將山毛豆種子蛋白質(zhì)分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。測定不同蛋白組分,了解山毛豆種子蛋白的基本組成,表 1表示山毛豆種子各組分蛋白的含量。

表 1 各組分蛋白在山毛豆種子中的分布

表 1表明,山毛豆種子的清蛋白含量最高,占山毛豆種子總蛋白的 64.04%,為組成山毛豆種子蛋白的主要成分。另外含有球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,分別占總蛋白的 8.83%,11.06%和 14.50%左右,以及少量難溶的復合蛋白(1.57%)。

2.2 等電點測定結果

2.2.1 等電點預實驗結果 沉淀結果表明,山毛豆清蛋白的最佳沉淀結果應在 pH4～5,球蛋白最佳沉淀結果在 pH5左右。醇溶蛋白較優(yōu)沉淀結果在 pH5左右,谷蛋白較優(yōu)沉淀結果為 pH3～4左右。

2.2.2 雙縮脲法測定 為了較準確地測出山毛豆組分蛋白的等電點,根據(jù)植物性蛋白質(zhì)等電點大部分呈酸性特點,以 2.2.1的結果為依據(jù),分別設定不同pH間隔,利用雙縮脲法準確測定其等電點,結果如圖1～圖 4所示。

圖1 清蛋白在不同 pH下離心液吸光度

圖2 球蛋白在不同 pH下離心液吸光度

圖 3 醇溶蛋白在不同pH下離心液吸光度

圖4 谷蛋白在不同 pH下離心液吸光度

本實驗得到的山毛豆清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白離心液的吸光度隨 pH變化的趨勢明顯不同;而同種蛋白的不同濃度的的吸光度隨 pH變化的趨勢相同,而且隨著蛋白濃度的增加,離心液的吸光度明顯增大。清蛋白離心液的吸光度變化基本呈“U”型,球蛋白的變化呈“V”型,醇溶蛋白離心液的吸光度變化基本呈“√”型,谷蛋白離心液的吸光度變化基本呈反的“√”型。由圖 1可知,清蛋白離心液吸光值最小在pH4.3,這可能是由于在此pH下,蛋白質(zhì)多肽鍵之間的靜電推斥作用受到抑制,以及蛋白質(zhì)間的相互作用超過了蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用而引起了聚集反應,破壞了蛋白質(zhì)的空間結構,使蛋白質(zhì)溶解度最低[14]。利用雙縮脲法所測吸光值與蛋白質(zhì)量成正比的關系,可知在 pH為 4.3時離心液中蛋白質(zhì)含量最少,即在 pH4.3時清蛋白沉淀量最大,因此可確定山毛豆清蛋白等電點為 pH4.3。同理可確定山毛豆球蛋白、醇溶蛋白等電點分別為pH5.1,pH4.7,谷蛋白的等電點為 3.5～3.8。

2.3 溶解性

植物蛋白的溶解性是蛋白質(zhì)最重要的一個功能性質(zhì),蛋白質(zhì)的其它功能性質(zhì)如乳化性、起泡性、凝膠性等都與其溶解性有關。蛋白質(zhì)的溶解性受加工條件的影響很大,特別是 pH,在不同的 pH下,其溶解度有較大的差異。實驗表明,山毛豆種子的清蛋白和球蛋白分別在 pH4和 pH5附近溶解度均較小, pH＞4時,清蛋白的溶解度隨 pH的增大而增大,在當pH4～5之間時,球蛋白的溶解度較小,pH＜4或 ＞5時,球蛋白的溶解都比較大,其中清蛋白的 pH-NSI曲線形狀跟大豆蛋白相類似[11]。在實驗 pH范圍內(nèi),醇溶蛋白和谷蛋白其溶解度都比較小 (NSI＜30%),其中醇溶蛋白在 pH5時溶解度最小,而谷蛋白在pH4溶解度較小 (圖 5),這和 2.2測得的組分蛋白的等電點是一致的,即山毛豆組分蛋白的溶解度在等電點附近最低,離開等電點之后隨著堿量的增加(增大 pH)和酸量的增加 (減小 pH)其溶解度增強。原因是在等電點附近蛋白質(zhì)多肽鏈之間的靜電推斥作用受到抑制,以及蛋白質(zhì)間的相互作用超過蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用引起聚集反應,從而破壞了蛋白質(zhì)的空間結構。蛋白質(zhì)分子電荷密度及疏水性是影響蛋白質(zhì)溶解度的主要因素,較高的電荷密度和較低的疏水性才能有較高的溶解度[12]。

圖5 山毛豆中各組分蛋白的pH-NSI曲線

2.4 SDS-PAGE電泳

由圖 6可知,非洲山毛豆種子總蛋白的相對分子量差異較大,在 20.1～97.2kDa及小于20.1kDa的均有分布,但其譜帶分布不明顯,說明其總蛋白的組成相對較復雜。清蛋白譜帶變化范圍為主要有 6條,變化區(qū)域集中在 20.1～66.4kDa及小于 20.1kDa的范圍,說明山毛豆清蛋白主要由低分子量亞基構成。球蛋白在 20.1～66.4kDa大約出現(xiàn)了 10條譜帶,說明了球蛋白組成的不均一性。醇溶蛋白在 20.1、29.0、44.3kDa分別有 3條明顯的譜帶,其中 29.0kDa的譜帶顏色最深,說明醇溶蛋白中此分子量的亞基含量最高,和前兩種蛋白比較,其組成相對較簡單,而且其相對分子量較小。谷蛋白在 20.1～97.2kDa大約有10條以上的譜帶,其組成也相對比較復雜。在山毛豆種子的分離提取中,采用連續(xù)提取法。由于清蛋白水溶性蛋白且含量高,所以采用直接提取法或提取清蛋白后依次提取其他蛋白。則各組分的譜帶都具有相似性。實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng) 3～4次重復提取后球蛋白已不含清蛋白譜帶。

圖 6 山毛豆總蛋白及各蛋白組分的 SDS-PAGE圖譜注：1-標準蛋白,2-總蛋白,3-清蛋白, 4-球蛋白,5-醇溶蛋白,6-谷蛋白

3 結論

非洲山毛豆種子蛋白質(zhì)主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等組成。其中,清蛋白含量最高,占總蛋白的 64.04%(m/m),球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相對百分含量分別為 8.83%(m/m),11.06% (m/m)和 14.50%(m/m)。另外,有少量難溶的復合蛋白,其相對含量為 1.57%(m/m)。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的等電點為 4.3、5.1和 4.7,谷蛋白的等電點為 3.5～3.8。清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別在其等電點附近溶解度最小,偏離等電點時清蛋白和球蛋白的溶解度較大,而醇溶蛋白和谷蛋白的溶解度較小。SDS-PAGE電泳表明了非洲山毛豆種子蛋白及各組分蛋白具有不同的分子組成。非洲山毛豆種子總蛋白的相對分子量差異較大,在20.1～97.2kDa及小于 20.1kDa的均有分布,但其譜帶分布不明顯。清蛋白譜帶變化范圍為主要有 6條,變化區(qū)域集中在 20.1～66.4kDa及小于 20.1kDa的范圍。球蛋白在 20.1～66.4kDa大約出現(xiàn)了 10條譜帶。醇溶蛋白在 20.1、29.0、44.3kDa分別有 3條明顯的譜帶。谷蛋白在 20.1～97.2kDa大約有 10條以上的譜帶。

和大豆 (蛋白含量 38%)[13]、花生 (蛋白含量22%～26%)[13]等蛋白含量較高的蛋白質(zhì)資源比較,山毛豆的蛋白含量較高(38.73%)。非洲山毛豆主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等組成,清蛋白是其主要成分。而大豆主要由清蛋白 (5%)和球蛋白(95%)組成。其中球蛋白是主要成分?；ㄉ鞍状蠹s 10%是水溶性的,其余 90%為花生球蛋白(63%)和伴花生球蛋白 (33%)[13]。和花生、大豆相比較,非洲山毛豆的水溶性蛋白含量最高。而蛋白質(zhì)的溶解度影響其功能性質(zhì),其中最受影響是增稠、起泡、乳化和膠凝作用,不溶性蛋白質(zhì)在食品中的應用是非常有限的[14],所以非洲山毛豆種子蛋白質(zhì)在食品中有廣泛應用的潛質(zhì)。

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Analysis of contents of protein groups in Tephrosia vogeliiHook f.seeds

L I Xiao-hua1,2,YU Xin2,＊,BIYang1
(1.College of Food Science and Engineering,Gansu AgriculturalUniversity,Lanzhou 730070,China; 2.College ofLight Industry and Food Science,ZhongkaiUniversity ofAgriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

Taking Tep hros ia voge liiHook f.seeds as raw m a te ria ls,p rote ins from seeds we re g raded and sep a ra ted, the content and isoe lec tric p oint and solub ility of seeds p rote in g roup s we re de te rm ined.The results showed tha t tota l p rote in content of defa tted seeds p owde rwas47.11%(m/m),the re la tive p e rcentage content of a lbum in was 64.04%,tha t of g lobulin,g liad in,and g lute lin was8.83%,11.06% and14.50%,resp ec tive ly,defa tted Tep hros ia voge liiHook f.seeds p owde r a lso conta ined a sm a ll quantity of comp ound p rote in(1.57%)which was d ifficult to d issolve.In add ition,isoe lec tric p oint of each seed p rote in g roup was d iffe rent,isoe lec tric p oint of a lbum in was pH 4.3,g lobulin pH5.1,g liad in pH4.7,g lute lin pH3.5～3.8,and the ir the solub ility was the wors t a t nea r isoe lec tric p oint. Solub ility of a lbum in and g lobulin we re be tte r but tha t of g liad in and g lute lin we re worse a t pH＞5or pH＜4. SDS-PAGE showed tha t the re was g rea t d iffe rence in the re la tive m olecula rwe ight of tota lp rote in from Tep hros ia voge liiHook f.seeds,its sp ec trum band was not d is tinc t but d is tributed in20.1～97.2kDa and less than20.1kDa.S ix sp ec trum bands of a lbum in concentra ted a t the range of20.1～66.4kDa and less than20.1kDa.tota lp rote in and the four solub ility frac tions had d iffe rent p olyp ep tide comp os itions.The re we re10sp ec trum bands a t the range of 20.1～66.4kDa for g lobulin.And three d is tinc t sp c trum bands a t20.1,29.0,44.3kDa for g liad in,resp ec tive ly.M ore than 10bands we re d is tributed from 20.1kDa to97.2kDa.Hence,tha t tota l p rote in and the four solub ility frac tions had d iffe rent p olyp ep tide comp os itions

defa tted Tep hros ia voge liiHook f.seeds;p rote in comp os ition;isoe lec tric p oint;solub ility;SDS-PAGE

TS201.2+1

A

1002-0306(2010)03-0158-04

非洲山毛豆 (Tephrosia vogeliiHook f.)又稱福氏灰毛豆、窩氏灰葉,屬豆科,蝶形花亞科,灰葉屬,多年生灌木。作為一種優(yōu)良的水土保持、護坡綠化、土壤改良植物[1-4],其原產(chǎn)于非洲,主要分布在北緯 15°至南緯 20°的廣大地區(qū),亞洲也有自然分布[5]。近 10多年來,我國廣東、廣西、海南、云南、貴州、四川、福建等省區(qū)大量種植。非洲山毛豆種子產(chǎn)量高,不需要人工水、肥管理,未發(fā)現(xiàn)病蟲害,不需要使用農(nóng)藥,荒山種植,不占用耕地。目前,尚未見中外文獻關于非洲山毛豆種子食用、飼用及營養(yǎng)價值的研究報道。我們前期研究結果表明,非洲山毛豆種子中粗蛋白含量為 38.73%(m/m)[6],說明其蛋白含量較高。本實驗進一步對非洲山毛豆種子蛋白進行了分級分離,測定了組分蛋白的等電點和溶解度,并對其進行SDS-PAGE電泳分析,確定出各組分蛋白的分子量范圍,以期為非洲山毛豆作為新的蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用提供部分理論依據(jù)。

2009-02-02 ＊通訊聯(lián)系人

李小華(1978-),女,在讀碩士研究生。

廣東省科技計劃資助項目(2008B030302001)。