孫廣仁，張啟昌，董鳳英，趙洪南，杜鳳國(guó),*

(1.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024)

藍(lán)靛果酵母發(fā)酵特性的研究

孫廣仁1,2，張啟昌1，董鳳英1，趙洪南1，杜鳳國(guó)1,*

(1.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024)

以藍(lán)靛果果實(shí)為原料，經(jīng)酵母菌富集培養(yǎng)后，分離純化得到優(yōu)勢(shì)酵母菌，并對(duì)其進(jìn)行耐酸、耐酒精、耐亞硫酸及降酸實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上利用活化的藍(lán)靛果酵母菌進(jìn)行藍(lán)靛果酒的發(fā)酵。結(jié)果表明：藍(lán)靛果酵母菌能夠較好地利用檸檬酸與蘋果酸，而利用酒石酸的能力較差，并且有一定的耐酒精和耐亞硫酸能力。藍(lán)靛果酵母菌發(fā)酵使得果酒的酸度降低了13.2%，對(duì)高酸果酒的發(fā)酵具有較好的應(yīng)用前景。

藍(lán)靛果；酵母；發(fā)酵特性；生物降酸；果酒

藍(lán)靛果 (Lonicera enulis Turcz)又名藍(lán)靛果忍冬、羊奶子、黑瞎子果、山茄子果、藍(lán)果，屬忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木；喜冷涼濕潤(rùn)氣候，抗寒能力強(qiáng)，是一種新興的野生漿果資源。主要分布在東北、華北和西北的一些地區(qū)，東北的長(zhǎng)白山地區(qū)和大、小興安嶺野生資源貯量最大[1-4]。果實(shí)為漿果，果汁為鮮艷的深玫瑰色，果味酸甜，含有氨基酸、多種糖類、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素和微量元素等[5]。長(zhǎng)白山區(qū)的藍(lán)靛果總酸含量可達(dá)2.8%以上[6]，是一種高酸漿果，可用于生產(chǎn)飲料、加工果脯與果醬、發(fā)酵果酒、開發(fā)色素等[7-14]。由于藍(lán)靛果提取物具有降壓、抗疲勞、抗氧化及抗癌的作用而受到廣泛關(guān)注[15-18]。近年來，雖然對(duì)藍(lán)靛果的加工及其功能進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)藍(lán)靛果酵母菌特性的研究卻較少，尤其是對(duì)藍(lán)靛果酵母菌的降酸作用研究極少。不同的酵母菌株對(duì)果酒的香氣程度具有明顯影響[19]，采用純種酵母菌與混合酵母菌發(fā)酵的果酒的香氣成分與風(fēng)味有明顯差別，同一菌株對(duì)不同含糖量的果汁發(fā)酵其揮發(fā)性成分也有所不同[20]，對(duì)發(fā)酵酒酵母菌的研究已逐步引起釀造行業(yè)的重視[21-25]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)野生藍(lán)靛果酵母特性進(jìn)行發(fā)酵特性研究，為優(yōu)化藍(lán)靛果酒的發(fā)酵工藝提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果鮮果采自長(zhǎng)白山區(qū)吉林省撫松縣松江河鎮(zhèn)；一級(jí)白砂糖 黑龍江依安瑞雪糖業(yè)有限公司。

檸檬酸、蘋果酸、酒石酸 陽江市港陽香化企業(yè)優(yōu)先有限公司；亞硫酸 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10g、蔗糖10g、KH2PO43g、MgSO4·7H2O 5g、氯霉素0.01g，加水至1000mL，pH值自然，121℃滅菌20min。孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基：配方見GB 4789—2010《食品霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)》。

1.2 儀器與設(shè)備

722N型分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海線描新苗醫(yī)療器械制造有限公司；BSD-250程控全溫振蕩培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司；一等標(biāo)準(zhǔn)酒精計(jì)(已校正) 上海醫(yī)療控溫儀器廠；手持糖度計(jì) 北京德明達(dá)光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)靛果酵母菌活化液的制備

1.3.1.1 發(fā)酵醪的制備

將新鮮的藍(lán)靛果果漿(按漿果2～3倍量加水，控制總酸含量10g/L以下)按60mg/L二氧化硫質(zhì)量濃度添加亞硫酸，置于經(jīng)滅菌的三角瓶中，棉塞封口，每隔12h振蕩1次，室溫下當(dāng)自然發(fā)酵有大量氣泡產(chǎn)生并且有明顯酒味后，用滅菌脫脂紗布過濾制成藍(lán)靛果發(fā)酵醪，4℃保存。

1.3.1.2 優(yōu)勢(shì)酵母菌的分離與純化

吸取新制備的藍(lán)靛果發(fā)酵醪1mL，加入到50mL滅菌的富集培養(yǎng)基中，28℃搖床(160r/min)培養(yǎng)48h，在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上對(duì)其不同稀釋度的發(fā)酵醪進(jìn)行劃線，28℃培養(yǎng)3～5d，對(duì)優(yōu)勢(shì)酵母菌的菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)3次，得到的純菌株于4℃以斜面試管(孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基)保存。

1.3.1.3 酵母菌活化液的制備

菌種使用前于室溫放置1h，于超凈工作臺(tái)上挑取試管保存的酵母菌落于裝有50mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床(160r/min)培養(yǎng)48h，再將此酵母液擴(kuò)大培養(yǎng)到1L，得藍(lán)靛果酵母菌活化液。于4℃保存。

1.3.2 藍(lán)靛果酵母菌發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 耐糖能力實(shí)驗(yàn)

稱取50.0g蔗糖用新配制的富集培養(yǎng)基溶解并定容至100mL，配制成質(zhì)量濃度為50g/100mL的蔗糖母液，于121℃滅菌20min。取10mL試管，分別加入蔗糖母液2、3、4、5、6、8 mL，用滅菌后的富集培養(yǎng)基補(bǔ)足9.0mL，再加入1.0mL藍(lán)靛果酵母活化液，得到蔗糖質(zhì)量濃度分別為10、15、20、25、30、40g/100mL的發(fā)酵液，28℃搖床(160r/min)培養(yǎng)24h。分別以不加酵母液的含相應(yīng)質(zhì)量濃度蔗糖的液體培養(yǎng)基為對(duì)照，于波長(zhǎng)560nm處測(cè)吸光度。

1.3.2.2 耐二氧化硫能力實(shí)驗(yàn)

取滅菌后的10mL試管，分別加入質(zhì)量濃度為0.6mg/mL的亞硫酸稀釋液0.5、1、1.5、2、3、4mL，用新配制的富集培養(yǎng)基補(bǔ)足9.0mL，再加入1.0mL藍(lán)靛果酵母活化液，得到質(zhì)量濃度分別為30、60、90、120、180、240mg/L的二氧化硫發(fā)酵液，28℃搖床(160r/min)培養(yǎng)24h。分別以不加酵母液的含相應(yīng)質(zhì)量濃度亞硫酸的液體培養(yǎng)基為對(duì)照，于波長(zhǎng)560nm處測(cè)吸光度。

1.3.2.3 耐酒精能力實(shí)驗(yàn)

取滅菌后的10mL試管，分別加入0.8、1.2、1.6、2、3、4 mL無水酒精用新配制的富集培養(yǎng)基補(bǔ)足9.0mL，再加入1.0mL藍(lán)靛果酵母活化液，得到體積分?jǐn)?shù)為8%、12%、16%、20%、30%、40%的發(fā)酵液，28℃搖床(160r/min)培養(yǎng)24h。分別以不加酵母液的含相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)酒精的液體培養(yǎng)基為對(duì)照，于波長(zhǎng)560nm處測(cè)吸光度。

1.3.2.4 耐酸能力實(shí)驗(yàn)

用新配制的富集培養(yǎng)基分別配制成質(zhì)量濃度為10g/100mL檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和混合酸(檸檬酸:蘋果酸:酒石酸質(zhì)量比為1:1:1)的酸母液，121℃滅菌20min制得酸液。

取10mL試管，按5、10、15、20、30、40g/L的質(zhì)量濃度加入酸液，用新配制的富集培養(yǎng)基補(bǔ)足9.0mL，再加入1.0mL藍(lán)靛果酵母活化液，搖床(160r/min)培養(yǎng)24h。分別以不加酵母液的含相應(yīng)質(zhì)量濃度酸的富集培養(yǎng)基為對(duì)照，于波長(zhǎng)560nm處測(cè)吸光度。

1.3.3 藍(lán)靛果果酒的發(fā)酵

藍(lán)靛果果漿制備：將2.5t(保藏時(shí)添加質(zhì)量濃度6g/L的亞硫酸4L)經(jīng)過擠壓破碎后再補(bǔ)加亞硫酸3L、水1t、白砂糖0.5t，蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到18g/100mL，總二氧化硫含量84mg/L。

藍(lán)靛果發(fā)酵母液的制備：取500mL酵母菌活化液(按1.3.1.3節(jié)方法制備)加入到65℃滅菌30min的5L藍(lán)靛果果漿中，28℃搖床培養(yǎng)24h的藍(lán)靛果果漿)，再于38～40℃恒溫條件下加入250g白沙糖、500g釀酒酵母，活化40min，冷卻，加入10L藍(lán)靛果果漿并對(duì)其充分混勻，室溫放置2h，得到藍(lán)靛果發(fā)酵母液。

果酒發(fā)酵：將上述藍(lán)靛果發(fā)酵母液加入到藍(lán)靛果果漿中，攪拌。發(fā)酵24h后觀察，如果有大量氣泡產(chǎn)生，則表明發(fā)酵正常。發(fā)酵3d，酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到5%～6%時(shí)，補(bǔ)白沙糖至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，繼續(xù)發(fā)酵，每天攪拌，發(fā)酵12～15d主發(fā)酵結(jié)束后過濾，于冬季冷凍5d后過濾、陳釀。

1.3.4 降酸實(shí)驗(yàn)

取1g釀酒酵母加質(zhì)量濃度為2g/100mL蔗糖水溶液100mL按使用說明進(jìn)行活化，得人工酵母液。取1L三角瓶12支，分別加入藍(lán)靛果果漿1000mL，121℃滅菌20min。其中3支三角瓶分別加入10mL人工酵母液；3支三角瓶分別加入10mL藍(lán)靛果酵母活化液(按1.3.1節(jié)方法制得)；3支三角瓶分別加入5mL人工酵母液和5mL藍(lán)靛果酵母活化液；混勻后于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6個(gè)月。未接種酵母菌的空白以滅菌蒸餾水代替。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酸度。降酸率按下式計(jì)算。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定方法

游離二氧化硫、總酸、酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖、還原糖、干浸出物的測(cè)定按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》所規(guī)定的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)靛果酵母菌耐蔗糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)酵母活性的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on yeast activity

由圖1可知，蔗糖質(zhì)量濃度在10～25g/100mL范圍內(nèi)藍(lán)靛果酵母生長(zhǎng)良好，同時(shí)在10～15g/100mL之間藍(lán)靛果酵母活性出現(xiàn)一個(gè)峰值，說明在一定溫度下藍(lán)靛果酵母的生長(zhǎng)存在適宜的糖度。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度大于25g/100mL時(shí)蔗糖對(duì)藍(lán)靛果酵母菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。

2.2 藍(lán)靛果酵母菌耐二氧化硫?qū)嶒?yàn)結(jié)果

圖2 SO2 質(zhì)量濃度對(duì)酵母活性的影響Fig.2 Effect of SO2 concentration on yeast activity

從圖2可以看出，隨著二氧化硫質(zhì)量濃度的增加，藍(lán)靛果酵母菌生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)二氧化硫質(zhì)量濃度達(dá)到90mg/L時(shí)，A560nm值較初始(30mg/L)時(shí)值下降了一半，由此可見，在發(fā)酵過程中，視原料受微生物污染的情況應(yīng)盡可能減少二氧化硫的使用量。

2.3 藍(lán)靛果酵母耐酒精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 酒精體積分?jǐn)?shù)對(duì)酵母活性的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yeast activity

從圖3可以看出，隨著酒精體積分?jǐn)?shù)的增大，藍(lán)靛果酵母菌生長(zhǎng)明顯受到抑制，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，A560nm值已經(jīng)下降到很低的水平，可見，藍(lán)靛果酵母菌很難發(fā)酵20%以上酒精體積分?jǐn)?shù)的果酒，在發(fā)酵酒精體積分?jǐn)?shù)12%～16%果酒時(shí)藍(lán)靛果酵母菌活性較高。而一般果酒發(fā)酵的酒精體積分?jǐn)?shù)都在10%～17%之間，因此，藍(lán)靛果酵母菌適合于果酒的發(fā)酵。

2.4 藍(lán)靛果酵母耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 酸質(zhì)量濃度對(duì)酵母活性的影響Fig.4 Effect of organic acid type and concentration on yeast activity

從圖4可以看出，對(duì)檸檬酸與蘋果酸而言，在一定范圍內(nèi)A560nm值出現(xiàn)一個(gè)峰值，這說明藍(lán)靛果酵母菌發(fā)酵存在適宜的檸檬酸質(zhì)量濃度和蘋果酸質(zhì)量濃度，這與蔗糖相似，由此推斷，藍(lán)靛果酵母菌能夠利用檸檬酸與蘋果酸。而酒石酸與混合酸呈現(xiàn)A560nm值隨酸質(zhì)量濃度的增大而減小的趨勢(shì)，酒石酸減少的幅度大于混合酸，可見酒石酸對(duì)藍(lán)靛果酵母菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，同時(shí)從下降幅度看，混合酸雖然也呈現(xiàn)抑制趨勢(shì)，但較酒石酸幅度低。對(duì)藍(lán)靛果酵母菌的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為酒石酸＞混合酸＞檸檬酸＞蘋果酸。

2.5 藍(lán)靛果酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 降酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表1 降酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of experiments on acid degrading ability

將進(jìn)行降酸實(shí)驗(yàn)的三角瓶取出后補(bǔ)水至1000mL，分別測(cè)定總酸、總糖與酒精體積分?jǐn)?shù)。從表1可以看出，3種發(fā)酵方式的酵母菌都具有一定的降酸能力，其中混合酵母菌降酸能力最強(qiáng)；從殘?zhí)琴|(zhì)量濃度看，天然藍(lán)靛果酵母菌優(yōu)于人工酵母菌，混合酵母菌的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度最低，酒精體積分?jǐn)?shù)也比較高。

2.5.2 原酒分析

對(duì)發(fā)酵前的藍(lán)靛果果漿與發(fā)酵后得到的原酒進(jìn)行了分析，測(cè)定了總二氧化硫、干浸出物、酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖、還原糖與總酸含量，結(jié)果見表2。

表2 藍(lán)靛果發(fā)酵前后原汁與原酒的分析結(jié)果Table 2 Analytical results of chemical indexes of the fruit juice of Lonicera enulis before and after fermentation

從表2可以看出，發(fā)酵得到的藍(lán)靛果原酒的干浸出物、酒精體積分?jǐn)?shù)符合GB 15037—2006《葡萄酒》要求，而殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為5.6g/L略高(＜4g/L)，可以用于干酒調(diào)配?？偹豳|(zhì)量濃度由原來的18.2g/L降低到15.8g/L，降酸率為13.19%，表現(xiàn)出藍(lán)靛果酵母菌具有一定的降酸能力。

3 討 論

3.1 蔗糖質(zhì)量濃度在10～25g/100mL范圍內(nèi)，藍(lán)靛果酵母菌活性出現(xiàn)一個(gè)峰值，表明蔗糖在適宜的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)其生長(zhǎng)有利，可見酵母在發(fā)酵果酒過程中，如果要加快發(fā)酵速度，應(yīng)保持適宜的糖質(zhì)量濃度使其保持最大的發(fā)酵速度，這也為分次加糖提供了指導(dǎo)。

3.2 酒精與二氧化硫?qū)λ{(lán)靛果酵母菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，藍(lán)靛果酵母菌對(duì)發(fā)酵低度酒(酒精體積分?jǐn)?shù)＜8%)有利，而隨著酒精體積分?jǐn)?shù)的增大，藍(lán)靛果酵母菌活性顯著下降，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)為13%時(shí)，A560nm值下降到低度酒(＜8%)時(shí)的一半，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，A560nm值則下降80%，說明酒精對(duì)藍(lán)靛果酵母具有較強(qiáng)的抑制作用，藍(lán)靛果酵母適用于發(fā)酵酒精體積分?jǐn)?shù)為8%～13%的果酒，能夠滿足目前對(duì)一般果酒發(fā)酵的需求。通過耐二氧化硫?qū)嶒?yàn)表明，藍(lán)靛果酵母對(duì)二氧化硫雖然較為敏感，但二氧化硫質(zhì)量濃度在90mg/L的條件下，A560nm值下降到二氧化硫質(zhì)量濃度在30mg/L的一半。所以，二氧化硫的使用質(zhì)量濃度在90mg/L以下，藍(lán)靛果酵母能夠生長(zhǎng)，超過180mg/L時(shí)酵母生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，這對(duì)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)具有一定的實(shí)踐意義。

3.3 對(duì)比人工酵母與藍(lán)靛果酵母菌以及混合酵母菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)可以看出，無論是人工酵母還是藍(lán)靛果酵母都具有一定的降酸能力，而藍(lán)靛果酵母菌(9.14%)比人工酵母(3.76%)降酸能力強(qiáng)，但都比混合酵母降酸能力(12.90%)低，這可能是由于不同酵母的代謝之間存在交互作用或相互影響，通過深入研究不同酵母菌對(duì)有機(jī)酸利用以及糖代謝的相互作用可知，其對(duì)開發(fā)復(fù)合酵母發(fā)酵劑有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。與人工酵母菌比較，雖然藍(lán)靛果酵母菌在發(fā)酵藍(lán)靛果酒方面表現(xiàn)出一定的降酸能力，但這一特性是否對(duì)其他果汁的發(fā)酵有普遍意義還有待進(jìn)一步研究。

3.4 從藍(lán)靛果酵母菌耐酸實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，檸檬酸的質(zhì)量濃度5～15g/L、蘋果酸質(zhì)量濃度5～10g/L范圍內(nèi)對(duì)藍(lán)靛果酵母菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，說明藍(lán)靛果酵母菌能夠利用檸檬酸與蘋果酸，而高質(zhì)量濃度酸則對(duì)其表現(xiàn)為抑制作用。由此可見，在發(fā)酵果酒過程中，除了要調(diào)整適當(dāng)?shù)乃岫韧猓€要了解果汁中酸的組成，為探尋最佳的發(fā)酵工藝提供依據(jù)。由于酵母菌利用不同酸的程度不同，從而改變了發(fā)酵酒的有機(jī)酸組成，進(jìn)而影響發(fā)酵酒的口味，探討酵母菌對(duì)不同有機(jī)酸的利用程度對(duì)進(jìn)一步研究釀酒工藝是非常有意義的。

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Fermentation Characteristics of Yeast from Lonicera edulis Fruits

SUN Guang-ren1,2，ZHANG Qi-chang1，DONG Feng-ying1，ZHAO Hong-nan1，DU Feng-guo1,*
(1. Forestry College of Beihua University, Jilin 132013, China；2. School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024, China)

The predominant yeast strain isolated from Lonicera edulis fruits after enrichment culture was tested for its acidresistant, alcohol-resistant, sulfurous acid-resistant and acid degrading properties. This was followed by fermentation of Lonicera edulis fruit wine with this strain after activation. It was found that this yeast strain could utilize citric acid and malic acid well and its ability to utilize tartaric acid was bad. Meanwhile, this yeast strain exhibited the resistance to sulfurous acid and alcohol. Moreover, fermentation with it resulted in a 13.2% decrease of acidity in Lonicera edulis fruit wine. Therefore, this strain will have promising application prospect in the fermentation of high-acidity fruit wine.

Lonicera edulis；yeast；fermentation characteristics；bio-deacidification；fruit wine

TS262.7

A

1002-6630(2010)23-0305-05

2010-09-28

國(guó)家林業(yè)局“948”支撐項(xiàng)目(2008-4-15)

孫廣仁(1964—)，男，教授，博士研究生，主要從事微生物利用研究。E-mail：sungr8189@163.com

杜鳳國(guó)(1960—)，男，教授，博士，主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：dfg4656@hotmail.com