趙國琴

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州 730030）

缺氧誘導(dǎo)因子-1α在大腸癌及癌旁組織芯片中的表達(dá)及其臨床意義

趙國琴

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州 730030）

目的探討大腸癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α的表達(dá)及其臨床意義。方法將50例大腸癌手術(shù)標(biāo)本和10例相應(yīng)癌旁及14例正常大腸組織制作成組織芯片，同時(shí)將17例大腸腺瘤活檢標(biāo)本制作成常規(guī)切片，應(yīng)用免疫組化SABC法研究HIF-1α在它們中的表達(dá)。結(jié)果HIF-1α在大腸癌組織的陽性表達(dá)率為64.0%（32/50），明顯高于其正常大腸組織中的28.6%（4/14）（P＜0.05）；在正常大腸組織和腺瘤組織中的陽性表達(dá)率有顯著性差異（P＜0.05）；在癌旁組織和大腸癌組織中的陽性表達(dá)率無顯著性差異（P＞0.05）；在腺瘤組織和大腸癌組織中的陽性表達(dá)率無顯著性差異（P＞0.05），在大腸癌組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別、組織分化程度無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論HIF-1α在大腸癌組織中表達(dá)增高，可能在大腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用。

大腸癌；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；組織芯片；免疫組化

缺氧誘導(dǎo)因子l（HIF-1）是一種分布及作用十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子[1]，是由HIF-1α、HIF-1β組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，決定了其活性，在腫瘤的血管生成、細(xì)胞生存、葡萄糖代謝、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。HIF-1α在多種腫瘤組織和細(xì)胞株的表達(dá)已有研究[2，3]。但利用組織芯片技術(shù)研究HIF-1α在正常大腸組織到腺瘤組織再到大腸癌組織中的表達(dá)、發(fā)展中的作用在國內(nèi)報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組化SABC法檢測HIF-1α在50例大腸癌、17例大腸腺瘤、10例相應(yīng)癌旁及14例正常大腸組織中的表達(dá)，旨在探討大腸癌組織中HIF-1α的表達(dá)及其與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 材料收集蘭州市城關(guān)區(qū)人民醫(yī)院、蘭州石化總醫(yī)院及甘肅省腫瘤醫(yī)院近3年大腸癌和大腸腺瘤存檔蠟塊，通過切片、HE染色，鏡下選取代表性蠟塊67例，其中大腸癌手術(shù)標(biāo)本50例，大腸腺瘤活檢標(biāo)本17例；另選癌旁大腸黏膜組織10例、正常大腸組織14例作為對照。50例大腸癌病例中男性24例，女性26例，年齡40～76歲，中位年齡58.5歲，≤50歲12例，＞50歲38例。按組織學(xué)分化程度分為高分化腺癌18例，中分化腺癌21例，低分化腺癌11例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例；Dukes（A+B）期14例，Dukes（C+D）期36例。50例大腸癌患者術(shù)前均未接受放療和化療，均調(diào)取其完整的臨床資料。

1.1.2 試劑兔抗人HIF-1α多克隆抗體（濃縮型）及SABC試劑盒（購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作首先選擇所需大腸癌病例存檔蠟塊，根據(jù)HE切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位并標(biāo)記。預(yù)先制備25mm×25mm×20mm的空白蠟塊，用組織芯片儀按設(shè)計(jì)好的位置在空白蠟塊上用點(diǎn)陣6×7的空心針打孔，每孔直徑1.2mm，間距1.0mm，排成6行×7列共42點(diǎn)微陣列，然后在選取的癌（富有癌細(xì)胞且無壞死出血區(qū)域）、相應(yīng)癌旁（距腫瘤0.5cm的無癌細(xì)胞組織）及正常大腸組織中的標(biāo)記部位穿刺取直徑1.2mm，準(zhǔn)確放入空白蠟塊小孔內(nèi)，按序操作，直至將所有組織標(biāo)本放入空白蠟塊中并加以記錄，共制備2塊組織芯蠟塊，其中每個(gè)組織芯蠟塊含42個(gè)組織芯（包括2個(gè)標(biāo)記點(diǎn)），最后將制成的組織芯蠟塊面朝下放在銅板上，于55℃放置30min，輕壓模塊使組織柱在模塊中排平，冷卻至室溫，再放入-20℃冰箱內(nèi)6min。

1.2.2 切片將已制備好的組織芯片及17例大腸腺瘤組織蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片，厚度4um，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片3張，1張HE染色，2張貼于經(jīng)1%多聚賴氨酸處理的潔凈載玻片上，經(jīng)56℃烤箱干燥后，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 免疫組化采用SABC免疫組織化學(xué)法染色，取4um厚石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡，微波抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色和蘇木素復(fù)染，用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 結(jié)果判定光學(xué)顯微鏡下，采用雙盲法觀片。細(xì)胞漿中出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，按每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)百分比記分：陽性細(xì)胞數(shù)小于5%為0分，陽性細(xì)胞數(shù)為5%～25%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)為26%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)為51%～75%為3分，陽性細(xì)胞數(shù)大于75%為4分。同時(shí)按著色強(qiáng)度記分：染色弱，呈淡黃色為1分；染色中等，呈黃色為2分；染色強(qiáng)，呈棕黃色為3分。2種記分的乘積決定病例的結(jié)果：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)和Fisher’s精確概率法，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α在不同大腸病變組織中的陽性表達(dá)

HIF-1α主要定位于胞核或胞質(zhì)，為棕色或棕黃色顆粒，主要在癌細(xì)胞、腺瘤細(xì)胞中表達(dá)（見圖1、圖2，SABC法，X400）;在正常黏膜細(xì)胞中低表達(dá)，見表1。

表1 HIF-1α在不同大腸病變組織中的陽性表達(dá)率

圖1 HIF-1α在大腸癌組織中的表達(dá)

圖2 HIF-1α在大腸腺瘤組織中的表達(dá)

2.2 HIF-1α表達(dá)與大腸癌臨床病理特征間的關(guān)系

大腸癌組織中，HIF-1α的表達(dá)與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），腫瘤淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移和Dukes分期較高者HIF-1α的表達(dá)均明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移和Dukes分期較低者，存在顯著性差異（P＜0.05）。HIF-1α的表達(dá)與患者性別、年齡、組織分化程度無關(guān)（P＞0.05），見表2。

缺氧是實(shí)體性腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，血管生成和細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。在缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)許多基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)生變化，對缺氧做出應(yīng)激反應(yīng)（HRG）。HIF-1α是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核蛋白，它與靶基因結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，使機(jī)體產(chǎn)生一系列缺氧適應(yīng)反應(yīng)。HIF-1α通過激活靶基因，而發(fā)揮舒張血管，增加血管通透性，促進(jìn)血管生成，增加糖酵解作用，以及增加糖酵解來改善機(jī)體供氧及能量代謝需要，這對于因組織增生過快必然導(dǎo)致局部組織嚴(yán)重缺氧的腫瘤來說，有非常大的促進(jìn)作用。

表2 HIF-1α的表達(dá)與大腸癌臨床病理特征間的關(guān)系

本研究用組織芯片技術(shù)及免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)HIF-1α在正常大腸組織、癌旁組織、大腸腺瘤組織及大腸癌組織的表達(dá)分別為28.6%、40.0%、58.8%、64.0%，顯示大腸組織從正常到腺瘤再到惡性轉(zhuǎn)化，HIF-1α的激活水平漸次增加，且在大腸癌、大腸腺瘤和正常組織的陽性表達(dá)率有顯著性差異，說明HIF-1α可能參與癌的進(jìn)展和發(fā)生。HIF-lα在癌旁組織和大腸癌組織的陽性表達(dá)率無顯著性差異，說明HIF-lα在癌旁有高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），腫瘤淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移和Dukes分期較高者HIF-1α的陽性表達(dá)率明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移和Dukes分期較低者，說明HIF-1α在大腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。眾多研究顯示，HIF-lα在多種人類腫瘤組織中有表達(dá)，甚至存在癌前病變中，提示腫瘤細(xì)胞缺氧發(fā)生在血管生成之前，并進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[4，5]。本研究中17例大腸腺瘤組織中有10例HIF-lα呈陽性表達(dá)，很可能HIF在癌前病變組織形成機(jī)制中起主要作用，是促進(jìn)大腸癌發(fā)生的關(guān)鍵。同時(shí)，本研究體會(huì)到應(yīng)用組織芯片進(jìn)行檢測，具有體積小、信息含量大、節(jié)省時(shí)間、節(jié)約經(jīng)費(fèi)、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)勢，可檢測大腸癌大樣本及HIF-1α在大腸癌不同階段的表達(dá)及其相關(guān)性，為臨床監(jiān)測大腸腺瘤癌變及其進(jìn)展提供有價(jià)值的指標(biāo)，為臨床早期診斷大腸癌提供可靠的理論依據(jù)，為大腸癌臨床病理診斷和判斷大腸癌惡性程度及預(yù)后提供可靠的參考指標(biāo)。

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1671-1246（2010）21-0144-02