米 薇, 王 晶, 應(yīng)萬濤, 賈 偉, 蔡 耘, 錢小紅＊

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院生物能源環(huán)境所,北京100013;2.蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京蛋白質(zhì)組研究中心,北京放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京102206)

基于共價(jià)色譜分離的含半胱氨酸肽段富集策略

米 薇1, 王 晶1, 應(yīng)萬濤2, 賈 偉2, 蔡 耘2, 錢小紅2＊

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院生物能源環(huán)境所,北京100013;2.蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京蛋白質(zhì)組研究中心,北京放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京102206)

多維色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)已在蛋白質(zhì)組研究中得到廣泛應(yīng)用。然而生物樣品的蛋白質(zhì)以及全酶切肽段具有高度的復(fù)雜性,這嚴(yán)重干擾了蛋白質(zhì)高通量、規(guī)?；姆治?。通過標(biāo)簽肽段富集進(jìn)行樣品預(yù)分離可以降低體系的復(fù)雜程度。本文建立了一種基于共價(jià)色譜技術(shù)選擇性分離富集含半胱氨酸肽的方法,從而降低了樣品體系的復(fù)雜程度。首先以牛血清白蛋白(BSA)的酶切肽段為模型,對(duì)富集條件進(jìn)行了優(yōu)化和考察,并在此基礎(chǔ)上通過5種蛋白質(zhì)酶切肽段混合物的富集對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果證明此方法的重現(xiàn)性好,富集效率高,富集特異性好,能有效地富集鑒定含半胱氨酸肽段。所建立的方法在復(fù)雜體系的蛋白質(zhì)組研究中具有廣泛的應(yīng)用前景,為復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì)高通量、自動(dòng)化、規(guī)?；b定和定量研究提供了實(shí)用技術(shù)。

共價(jià)色譜;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;含半胱氨酸肽;富集;蛋白質(zhì)組

Abstract:Automated multidimensional liquid Chromatography-tandem mass spectrometry(LCMS/MS)is routinely applied in large scale proteome profiling.How ever global proteome analysis remains a technical challenge due to the issues associated with sample complexity by tryptic digestion.The application of tag containing pep tide enrichment approach for sample pre-separation could reduce the complexity of protein digest.Here,we demonstrated a simple and highly efficient cysteine-containing pep tide enrichment method using a thiol specific covalent resin.The cysteine-containing pep tides from the tryptic digests of the complex proteinmixtures were selected by covalent Chromatography based on thiol-disulfide exchange,identified by mass spectrometry.The strategy was firstly optimized and evaluated by using the tryptic pep tides of bovine serum album in(BSA).Then the method was applied with a relatively complicated sample from a five standard protein mixture.The results of these studies show that the enrichment method of cysteine-containing pep tides is highly specific,efficient and reproducible.The effectiveness of this method in reducing the sample complexity and improving the identification of peptides by mass spectrometry has enabled high-throughput,automatic and large-scale qualitative and quantitative proteome analyses.

Key words:covalent Chromatography;liquid Chromatography-tandem mass spectrometry;cysteine-containing pep tides;enrichment;proteome

蛋白質(zhì)組學(xué)的基本目標(biāo)是盡可能地鑒定到生物體所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。隨著電噴霧電離(ESI)[1]和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALD I)[2]等質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和完善,質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組研究中發(fā)揮著重要的作用,使高通量分析生物體的蛋白質(zhì)組成成為可能。但生物體蛋白質(zhì)的高度復(fù)雜性嚴(yán)重干擾了質(zhì)譜鑒定,因此有必要對(duì)生物樣品進(jìn)行預(yù)分離以降低其復(fù)雜程度。

二維電泳(2D E)是分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物最常用的技術(shù),但它不能有效分離分子質(zhì)量過大或過小、等電點(diǎn)過高或過低、疏水性極強(qiáng)的蛋白質(zhì),這使其應(yīng)用受到一定的限制[3]?；诙嗑S色譜分離-串聯(lián)質(zhì)譜分析的鳥槍法(Shotgun)為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的手段[4,5],其基本技術(shù)路線是先對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行全酶切,再根據(jù)肽段的電荷、疏水性等特點(diǎn),通過多維毛細(xì)管液相色譜分離后對(duì)產(chǎn)生的復(fù)雜肽段混合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。這種方法自動(dòng)化程度高、通量高,對(duì)疏水和低豐度的蛋白質(zhì)沒有歧視效應(yīng),彌補(bǔ)了2D E分離蛋白質(zhì)的技術(shù)缺陷。

然而蛋白質(zhì)全酶切大大增加了肽段混合物的復(fù)雜程度[6],所以需要在肽段水平上對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離以降低肽段混合物的復(fù)雜程度。最常用的策略之一是采用標(biāo)簽肽分離技術(shù)來降低肽段混合物的復(fù)雜程度并減少待分析肽段的數(shù)目[7-9]。之所以可以采用這樣的策略是因?yàn)樵跀?shù)據(jù)庫和搜索軟件的幫助下,鑒定一個(gè)蛋白質(zhì)并不需要對(duì)其所有肽段進(jìn)行鑒定,具有高度序列特異性的一個(gè)肽段往往就可以作為標(biāo)簽肽用于其蛋白質(zhì)的鑒定。通過選擇性分離含低豐度氨基酸殘基的肽段,可以大大降低肽段混合物的復(fù)雜程度[10],從而提高標(biāo)簽肽的相對(duì)豐度及被鑒定的機(jī)會(huì)。

統(tǒng)計(jì)分析表明,酵母中有91.6%的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸殘基,而只有9.3%的酶切肽段含有半胱氨酸殘基;對(duì)人的Sw iss-Prot數(shù)據(jù)庫分析表明,有97.3%的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸殘基,而只有22.5%的酶切肽段含有半胱氨酸殘基。由此表明,基于含半胱氨酸肽富集的高特異性方法可以降低肽段混合物的復(fù)雜程度以及樣品的動(dòng)態(tài)范圍,從而降低高豐度和低豐度肽段的共流出對(duì)低豐度肽段所產(chǎn)生的質(zhì)譜抑制效應(yīng),有利于低豐度蛋白質(zhì)的鑒定。但對(duì)于不含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)和肽段,該方法具有缺陷性,但數(shù)據(jù)庫分析表明這部分蛋白質(zhì)不到10%,因此通過含半胱氨酸肽富集進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的策略已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組研究。Aebersold等[11]使用“同位素編碼親和標(biāo)簽”(ICAT)試劑,通過親和柱選擇性地分離富集含半胱氨酸的肽段,使分析體系得以簡化。Johnson等[12]通過二硫鍵的交換反應(yīng)可逆地將生物素標(biāo)記到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上,從而親和純化了含半胱氨酸肽段。Gevaert等[13]采用對(duì)角線色譜法(com bined fractional diagonal Chromatography,CO FRAD IC)策略,在蛋白質(zhì)酶切前用Ellm an’s試劑標(biāo)記半胱氨酸殘基,通過含巰基的肽段因脫去疏水性基團(tuán)而縮短保留時(shí)間,從而可以選擇性富集含半胱氨酸的肽段。D ai等[14]利用過甲酸氧化反應(yīng)使半胱氨酸肽段帶上磺酸基,再通過陽離子交換色譜來富集含半胱氨酸肽。然而這些純化方法還存在一些不足,例如依賴于生物素親和純化的富集方法在去除非特異性肽段吸附方面還存在問題:一些生物素化的半胱氨酸肽無法從親和素上洗脫造成回收率降低。另外,通過化學(xué)修飾改變半胱氨酸疏水性、電荷的富集方法不僅需要色譜分離進(jìn)行輔助,而且對(duì)肽段的化學(xué)修飾會(huì)造成肽段二級(jí)質(zhì)譜圖的復(fù)雜性,不便于標(biāo)記肽段的序列分析。

本文建立了一種基于巰基-二硫鍵交換反應(yīng)共價(jià)色譜富集含半胱氨酸肽的方法。這種富集方法簡單、高效、特異性好,富集過程無副反應(yīng),不會(huì)使含半胱氨酸肽帶上易于碎裂的片段。以牛血清白蛋白(BSA)及5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物為樣本對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化和考察,結(jié)果表明,該方法能有效地富集肽段混合物中含有半胱氨酸的肽段,從而降低了肽段混合物的復(fù)雜程度,使其能用于復(fù)雜樣本中含半胱氨酸肽高通量的富集,因此在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有一定的應(yīng)用前景。同時(shí),我們對(duì)富集過程中丟失的一些半胱氨酸肽段進(jìn)行了研究,對(duì)這些肽段的疏水性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,證實(shí)富集過程中一些極親水和極疏水性的肽段容易丟失,但這與體系的復(fù)雜程度無關(guān),只與肽段的屬性相關(guān)。這一結(jié)果為采用巰基-二硫鍵交換共價(jià)色譜富集含半胱氨酸肽的研究策略提供了參考信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

離心柱(HandeeTMM ini-Sp in Colum n,帶螺旋帽、填料塞、Luer-Lok接頭,900μL)、三(2-羧乙基)磷鹽酸(tris-(2-carboxylethyl)-phosphine,TCEP)購自Pierce公司巰丙基瓊脂糖凝膠6B(Thiopropyl Sepharose6B)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和尿素均購自GE公司。二硫蘇糖醇(dithiothreitol,D TT)、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)、甲酸(FA)購自美國Acros公司。胰酶(修飾、測(cè)序級(jí))購自美國Prom ega公司,三氟醋酸(TFA)購自Fluka公司,乙腈(ACN)購自Fisher公司,色譜純水由美國M illipore公司的純水設(shè)備制備。BSA、核糖核酸酶A(RNAS1)、溶菌酶(LYSC)、雞卵清蛋白(OVAL)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)均購自Sigm a公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

(2) WIFI指紋定位被稱為位置指紋是因?yàn)楦魑恢命c(diǎn)的WIFI信號(hào)被認(rèn)為是唯一的，通過比對(duì)“指紋”可更精準(zhǔn)地定位目標(biāo)位置。定位方式的優(yōu)點(diǎn)是定位準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率可在1 m范圍內(nèi),只需連入商圈WIFI即可定位，不受室內(nèi)環(huán)境的影響;缺點(diǎn)是需手機(jī)連入WIFI網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于部分需認(rèn)證用戶的WIFI網(wǎng)絡(luò)，在連入過程中需進(jìn)行密碼驗(yàn)證。

電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(ESI-LTQ-FTICR,美國Therm o Finnigan公司),毛細(xì)管液相色譜儀為Agilent1100系統(tǒng),包括一臺(tái)自動(dòng)上樣系統(tǒng)、一臺(tái)上樣泵(含一個(gè)十通閥)和一臺(tái)二元洗脫泵(Agilent公司)。高速低溫離心機(jī)(德國Heraeus公司);真空冰凍干燥機(jī)(SC100A Speedvac Plus,美國Therm o Savant公司);Sartorius B P211d分析天平(瑞士Sartorius公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)酶切肽段的制備

蛋白質(zhì)酶切:分別取BSA和蛋白質(zhì)混合樣品,加入溶液(50mmol/L Tris緩沖液(pH8.2),8 mol/L尿素,10mmol/L TCEP),于37℃下變性還原1h;將樣品用20mmol/L Tris緩沖液(pH8.2)稀釋10倍,然后按照1∶50(質(zhì)量比)加入胰酶,于37℃下酶切過夜。酶切完成后用C18SPE脫鹽柱(1 mL,100m g,美國Supelco公司)對(duì)酶切肽段混合物進(jìn)行脫鹽。

肽段還原:在脫鹽后的肽段中加入20μL5 mmol/L D TT(含有50mmol/L Tris緩沖液(pH 7.5),1mmol/L乙二胺四乙酸(ED TA)),于37℃下還原30m in,反應(yīng)完成后用緩沖液(50mmol/L Tris,pH7.5,1mmol/L ED TA)稀釋5倍。

1.2.2 巰丙基瓊脂糖凝膠6B共價(jià)色譜富集含半胱氨酸肽段

共價(jià)色譜柱的裝填:稱取33m g的巰丙基瓊脂糖凝膠6B填料粉末,用水浸泡15m in,然后將其轉(zhuǎn)入離心柱中(1g填料粉末的最終體積為3mL);用50倍離心柱體積的水清洗,再用50倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液(50mmol/L Tris,pH7.5,1mmol/L ED TA)沖洗。操作過程中要進(jìn)行脫氣:溶液采用充氮的方法進(jìn)行脫氣,巰丙基瓊脂糖凝膠6B填料用真空脫氣。

含半胱氨酸肽的富集:肽段在巰丙基瓊脂糖凝膠6B柱上保留2h,輕輕振蕩。低速離心離心柱,收集流出組分。然后依次用清洗緩沖液(50mmol/L Tris緩沖液(pH8.0),1mmol/L EDTA)、2mol/L NaCl溶液,80%ACN/0.1%TFA溶液、清洗緩沖液各0.5 mL洗滌巰丙基瓊脂糖凝膠6B柱。

含半胱氨酸肽段的洗脫:共價(jià)色譜柱中加入100μL20mmol/L D TT(含有50mmol/L Tris緩沖液(pH8.0),1mmol/L ED TA),在室溫下還原30m in,然后離心,收集洗脫液;柱中再加入100μL 80%ACN/0.1%TFA溶液洗脫;合并洗脫液,并在其中加入80mmol/L的IAA,于暗處烷基化30 m in;真空凍干,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。

LC分離:流動(dòng)相A為2%乙腈溶液(含0.1%甲酸);流動(dòng)相B為80%乙腈溶液(含0.1%甲酸)。洗脫梯度:0-50m in,2%B-40%B;50-60m in,40%B-100%B;60-65m in,100%B;然后用100%A平衡15m in。上樣體積為20μL,流速為300nL/m in。毛細(xì)管液相色譜儀所用毛細(xì)管色譜柱為自填C18反相柱(75μm×100mm,5μm)。

從反相色譜柱流出的洗脫組分直接進(jìn)入質(zhì)譜儀,由納升級(jí)電噴霧接口噴出。電噴霧電壓1.8 kV,離子傳輸毛細(xì)管溫度200℃;串聯(lián)質(zhì)譜分析采用一級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴二級(jí)質(zhì)譜掃描模式(data dependent MS/MS scan),依次選取一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最強(qiáng)的5個(gè)離子進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離(CID)二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜。采用動(dòng)態(tài)排除(dynam ic exclusion)功能,設(shè)置排除時(shí)間為0.5m in。二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜母離子窗口為4u,歸一化碰撞能量為35%;質(zhì)譜的一級(jí)全掃描范圍是m/z400～2 000。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫檢索

采集的原始文件首先通過B ioW orks3.2軟件轉(zhuǎn)換為dta文件,然后通過腳本程序m erge.p l將dta文件合并成m gf文件。使用M ascot(版本1.9)檢索m gf文件。檢索參數(shù):數(shù)據(jù)庫為Sw iss-Prot D atabase;半胱氨酸烷基化修飾(+57.021 4u)、甲硫氨酸(M et)氧化(+15.99u)設(shè)置為可變修飾。最大漏切位點(diǎn)為1個(gè),一級(jí)母離子的質(zhì)荷比誤差為0.002%,二級(jí)碎片離子的質(zhì)荷比誤差0.8u。肽段用Protparam軟件(http://au.expasy.org/tools/p rotparam.htm l)進(jìn)行疏水性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的原理

該方法富集含半胱氨酸肽段的原理如圖1所示:巰丙基瓊脂糖凝膠6B會(huì)與溶液中含有巰基基團(tuán)的物質(zhì)反應(yīng)生成二硫化物,并且釋放出2-巰基吡啶(2-thiopyridone)。因此肽段中半胱氨酸的巰基會(huì)與凝膠配基共價(jià)結(jié)合形成二硫鍵,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)含半胱氨酸肽段的選擇性富集,通過對(duì)富集色譜柱的洗滌去除不含有半胱氨酸的肽段以及釋放出來的2-巰基吡啶,富集在柱上的含半胱氨酸肽段通過加入還原劑D TT洗脫[15,16]。由于肽段與凝膠配基是共價(jià)結(jié)合,形成了牢固的復(fù)合物,因此可以采用嚴(yán)苛的清洗條件洗去以離子、疏水相互作用而非特異性結(jié)合的肽段組分,保證了富集的專一性和特異性。

圖1 基于巰丙基瓊脂糖凝膠6B共價(jià)色譜富集含半胱氨酸肽的原理Fig.1 Princip le for en richment of cyste ine-con ta in ing pep tides based on cova len t ch rom a tograp hy by Th iop ropyl Sepha rose6B

2.2 含半胱氨酸肽段的富集和鑒定

2.2.1 方法的優(yōu)化與考察

首先以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)BSA為研究對(duì)象進(jìn)行方法的優(yōu)化和考察。肽段樣品在富集之前需要保持半胱氨酸的巰基處于還原狀態(tài),所以在蛋白質(zhì)酶切時(shí)不能進(jìn)行烷基化。但這可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)的酶切,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的空間位阻會(huì)造成酶切不完全或者漏切位點(diǎn)過多,導(dǎo)致生成的肽段片段較大,從而影響含半胱氨酸肽段的富集。因此我們優(yōu)化了蛋白樣品的變性條件,對(duì)蛋白質(zhì)的酶切效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。我們考察了溶液1(50mmol/L Tris緩沖液(pH8.2),8 mol/L尿素)、溶液2(50mmol/L Tris緩沖液(pH 8.2),8mol/L尿素,10mmol/L TCEP)和溶液3(50mmol/L Tris緩沖液(pH8.2),8mol/L尿素,SDS0.5%,10mmol/L TCEP)的變性還原效果。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)的分析結(jié)果顯示溶液2和3均能使蛋白質(zhì)酶切完全,本文實(shí)驗(yàn)采用簡單體系的溶液2進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的變性還原。

該富集方法的關(guān)鍵是含半胱氨酸肽中的自由巰基與巰丙基瓊脂糖凝膠6B共價(jià)結(jié)合生成二硫鍵。由于巰基很活潑,在空氣中很容易被氧化,因此在肽段脫鹽后進(jìn)行富集之前需要在肽段中加入低濃度的還原劑D TT,以保證肽段中半胱氨酸的巰基處于還原狀態(tài)。另外,為了防止肽段中的巰基被溶液中的空氣氧化,富集過程中要進(jìn)行脫氣。

分別取10,20,50,100μg BSA溶于100μL水中,然后分別對(duì)其進(jìn)行富集。結(jié)果表明,20μg以上的BSA中85%以上的含半胱氨酸肽能被富集,低于20μg的BSA中被檢測(cè)到的含半胱氨酸肽數(shù)量顯著降低,這表明富集帶有半胱氨酸肽段的BSA最低質(zhì)量濃度約為0.2μg/μL,因此本文實(shí)驗(yàn)中每次取20μg的BSA溶于100μL水中進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 BSA酶切肽段的富集

對(duì)巰丙基瓊脂糖凝膠6B柱的流出組分、清洗緩沖液的洗脫組分進(jìn)行收集,然后用ESI-LTQ-FTICR串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。結(jié)果(見表1)顯示,流出組分和清洗緩沖液的洗脫組分中均沒有檢測(cè)到含半胱氨酸肽段,說明富集柱能充分富集含半胱氨酸肽段,從而達(dá)到與不含半胱氨酸肽段分離的目的。理論上BSA有25個(gè)含有半胱氨酸的肽段,該方法富集到22個(gè),富集率達(dá)到88%。與BSA的理論酶切肽段數(shù)相比,采用該方法富集后將樣品的復(fù)雜程度降低了一半,從圖2中能直觀地看出富集的效果。另外,在洗脫組分中沒有檢測(cè)到不含半胱氨酸的肽段,說明該富集方法的特異性好。由于含半胱氨酸肽段與巰丙基凝膠之間是牢固的共價(jià)結(jié)合,因此可以采用苛刻的洗滌條件,這也是該富集方法的優(yōu)勢(shì)之一。分別用清洗緩沖液、高濃度的鹽溶液以及加入TFA的有機(jī)溶劑進(jìn)行清洗,可充分去除富集柱上非特異性吸附的肽段。為了考察該方法的重復(fù)性,進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn)(完全相同的富集流程),獲得的3批數(shù)據(jù)(見表1中BSA的3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))中,3次富集到的半胱氨酸肽段分別為22,22,21個(gè),并且都沒有檢測(cè)到不含半胱氨酸的肽段。該方法富集鑒定到的肽段不僅置信水平為95%,而且含有的半胱氨酸殘基具有高度的序列特異性,使鑒定結(jié)果可靠。結(jié)果表明,該方法能高效、特異性地富集BSA中含半胱氨酸肽段。

表1 BSA和5種蛋白質(zhì)混合物酶切肽段含半胱氨酸肽的富集結(jié)果Table1 Results of cysteine-containing peptides isolated from tryptic digests of BSA and a complex of five p ro te ins

圖2 (a,c,e)未經(jīng)富集與(b,d,f)經(jīng)巰丙基瓊脂糖凝膠6B柱富集后的BSA酶切肽段中含半胱氨酸肽段的質(zhì)譜鑒定比較Fig.2 Comparison of RPLC-LTQ-FT analyses of cysteine-con taining peptides of BSA tryptic digests(a,c,e)without and(b,d,f)with enrichment by Thiopropyl Sepha rose6B

2.2.3 5種蛋白質(zhì)混合物酶切肽段的富集

為了確保目前適用于簡單標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)BSA中含半胱氨酸肽段的富集方法在復(fù)雜的實(shí)際樣品中可以有效應(yīng)用,我們又將其應(yīng)用在相對(duì)較復(fù)雜的5種蛋白質(zhì)混合物含半胱氨酸肽段的富集實(shí)驗(yàn),考察其在這個(gè)體系中的富集效率和特異性。平行實(shí)驗(yàn)2次,分別富集到36個(gè)和35個(gè)含半胱氨酸肽(見表1),占理論含有半胱氨酸肽段總數(shù)(45個(gè))的80%。同樣,洗脫組分中沒有檢測(cè)到不含半胱氨酸的肽段,只在流出組分中分別檢測(cè)到OVAL和GAPDH的1個(gè)含半胱氨酸肽段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,巰丙基瓊脂糖凝膠6B分離富集半胱氨酸肽段的方法在較復(fù)雜的樣品中也同樣有效。BSA理論上含半胱氨酸肽段占理論酶切肽段總數(shù)的45%,5種蛋白質(zhì)混合物中理論含半胱氨酸肽段占理論酶切肽段總數(shù)的36%,說明體系越復(fù)雜這種選擇性富集含半胱氨酸肽段的方法越能提高標(biāo)簽肽的相對(duì)豐度及被鑒定的機(jī)會(huì),大大降低肽段混合物的復(fù)雜程度。另外,這種利用巰丙基瓊脂糖凝膠6B對(duì)含半胱氨酸肽富集的方法與之前文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)富集研究結(jié)果[17]相比,富集效率和特異性都要好一些。

2.2.4 肽段理化屬性對(duì)富集結(jié)果影響的分析

我們發(fā)現(xiàn),在含半胱氨酸肽富集實(shí)驗(yàn)中,有一小部分含半胱氨酸肽段丟失(見表2),表2中列出的5種蛋白質(zhì)混合物酶切肽段的富集實(shí)驗(yàn)中丟失的BSA含半胱氨酸肽,在BSA酶切肽段的幾次平行富集實(shí)驗(yàn)也沒有鑒定到,這種丟失可能與體系的復(fù)雜程度無關(guān),而與肽段的理化屬性相關(guān)。我們對(duì)富集到的含半胱氨酸肽以及丟失的含半胱氨酸肽的疏水性和肽段的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,圖3結(jié)果顯示富集過程中丟失的肽段是一些高親水性的小肽和高疏水性的肽段(橢圓圈出部分)。我們推測(cè)這種丟失可能與富集過程中的反相色譜脫鹽有關(guān),高親水性含半胱氨酸肽特別是小肽在富集過程中可能沒有被吸附在柱上而直接流出脫鹽柱,而高疏水性的肽則可能由于疏水性強(qiáng)而沒有被洗脫下來,導(dǎo)致樣品中有些含半胱氨酸肽沒有被檢測(cè)到。

圖3 富集到的含半胱氨酸肽以及丟失的含半胱氨酸肽的疏水性和肽段的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)相關(guān)圖Fig.3 Relationship be tween relative molecular mass(Mr)and GRAVY(grand ave rage of hydrop a thicity)scores of theidentified and nonidentified cysteine-containing peptides

表2 富集樣品中沒有鑒定到的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中含有的半胱氨酸肽段Tab le2 Non-identified cysteine-containing pep tides from the enrichment experiments

3 結(jié)論

本文建立了一種基于巰丙基瓊脂糖凝膠6B共價(jià)色譜技術(shù)選擇性分離富集含半胱氨酸肽段的方法。首先以BSA酶切肽段為模型,對(duì)富集條件進(jìn)行了優(yōu)化和考察,并在此基礎(chǔ)上通過5種蛋白質(zhì)酶切肽段混合物對(duì)該富集方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果證明,該方法的重現(xiàn)性好,富集效率高,富集率達(dá)80%以上,富集特異性好,對(duì)含半胱氨酸肽有非常好的選擇性。因此本方法可以有效地富集鑒定含半胱氨酸肽段,且在復(fù)雜體系的蛋白質(zhì)組研究中具有廣泛的應(yīng)用前景,為復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì)自動(dòng)化、規(guī)模化鑒定和定量分析提供了實(shí)用技術(shù)。另外,我們發(fā)現(xiàn)富集實(shí)驗(yàn)中丟失了一些高親水性和高疏水性的肽段,推測(cè)這種丟失可能與富集過程中的反相色譜脫鹽有關(guān),在以后的研究中若減少富集過程中的脫鹽步驟,或者加入有機(jī)改性劑增強(qiáng)高親水肽的保留以及高疏水性肽的洗脫,可能會(huì)更加提高該方法的富集效率。

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Enrichment strategy of cysteine-containing peptides based on covalent chromatography

MIWei1,WANG Jing1,YING Wantao2,JIA Wei2,CAI Yun2,QIAN Xiaohong2＊
(1.Department of Biology,Energy and Environment,National Institute of Metrology,Beijing 100013,China;2.State Key Laboratory of Proteomics,Beijing Proteome Research Center,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 102206,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0108-07

＊通訊聯(lián)系人:錢小紅,研究員,博士生導(dǎo)師.Tel:(010)80705055,E-m ail:qianxh1@yahoo.com.cn.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007CB914104)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Nos.20735005,20635010)、國家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(No.2008ZX08012-003)和國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(2008ZX10207).

2009-12-18

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00108