張愛芝, 王全林＊, 沈 堅, 張書芬, 陳立仁

(1.寧波市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,浙江寧波315041;2.中國科學院蘭州化學物理研究所,甘肅蘭州730000)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定魚制品中殘留的7種性激素

張愛芝1, 王全林1＊, 沈 堅1, 張書芬1, 陳立仁2

(1.寧波市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,浙江寧波315041;2.中國科學院蘭州化學物理研究所,甘肅蘭州730000)

以電噴霧離子源(ESI)為電離源,在正離子采集模式下建立了魚制品中7種性激素(甲基炔諾酮、甲基睪酮、丙酸睪酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、諾龍)的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。樣品被酶解后用甲醇提取,提取液經(jīng)氯化鋅(ZnCl2)去脂、LC-C18和LC-NH2固相萃取柱凈化、W aters ACQU ITYTMU PLC BEH-C18色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm)分離,在多反應監(jiān)測模式下進行U PLC-MS/MS分析。7種性激素的方法檢出限(S/N=3)為0.08～0.17μg/kg,定量限(S/N=10)為0.24～0.58μg/kg?？疾炝藘?nèi)標法和基質(zhì)匹配外標法對7種性激素進行定量的回收率與精密度:添加水平為1,4μg/kg時,以內(nèi)標法定量,7種性激素的平均回收率為76%～118%,相對標準偏差(RSD)為5.0%～11.3%;以基質(zhì)匹配外標法定量,7種性激素的平均回收率為66%～94%,RSD為4.5%～10.7%。該結(jié)果表明兩種方法均能夠滿足魚制品中7種性激素的多殘留檢測要求。應用建立的方法對市售脫脂大黃魚及烤魚片進行檢測,未發(fā)現(xiàn)7種目標違禁性激素。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;性激素;多殘留;魚制品;ZnCl2去脂

Abstract:A rap id,specific and highly sensitive method for the determination of seven sexhormones(norgestrel,methyltestosterone,testosterone propionate,medroxy progesterone acetate,megestrol acetate,chlormadinone acetate,and nandrolone)residues in fish p roducts was developed using ultra performance liquid Chromatography-tandem mass spectrometry(U PLCMS/MS)with electrospray ionization(ESI)in positive m ode.The target com pounds were extracted with m ethanol after the enzyme hydrolysis of the fish products.ZnCl2was added to the extract solution to remove lip ids.Then target com pounds were purified by an LC-C18and an LCNH2solid phase extraction cartridges.The target com pounds were separated on a Waters ACQU ITYTMU PLC BEH-C18column(100mm×2.1mm,1.7μm)and detected qualitatively and quantitatively inmulti reaction monitoring(MRM)m ode.For the seven sexhormones,the limits of detection(LOD)of the method were from0.08to0.17μg/kg and the limits of quantification(LOQ)were in the range of0.24-0.58μg/kg.A t the spiked levels of1and4μg/kg,the average recoveries ranged from76%to118%with the relative standard deviations between 5.0%and11.3%for the seven sexhormones using internal standard method;and the average recoveries ranged from66%to94%with the relative standard deviations between4.5%and 10.7%using matrix m atched external standard method.The results show ed that both methods are able to meet the m ulti-residue detection of the seven sex hormone residues in fish products.The degreased large yellow croaker and roast fish fillet real samples from a local market were detected by the developed method,and the seven targets were not found.

Key words:ultra perform ance liquid Chromatography-electrosp ray tandem mass spectrometry(U PLC-MS/MS);sexhormones;multi-residues;fish p roducts;ZnCl2delipidation

食用動物飼養(yǎng)中促生長性激素的使用已經(jīng)成為全球性的食品安全問題。研究表明,兒童性早熟、婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率上升與動物性食品中性激素殘留有關(guān)[1,2],因而歐盟在1996年[3]、我國在2002年[4]相繼頒布法令,禁止合成性激素及具有促生長效用的物質(zhì)作為促生劑在食用動物飼養(yǎng)中使用。但違規(guī)使用的案例仍時有出現(xiàn)[5-7]。人們對動物源性食品中性激素殘留檢測的呼聲日益增強。

食品中外源性激素多殘留檢測方法最常用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[11-14]。GC-MS的衍生過程繁瑣且會帶來一些副反應;LC-MS以其靈敏度高、選擇性和特異性好、前處理相對簡單而成為性激素殘留檢測中的首選方法。然而,大多數(shù)的研究集中在豬肉、牛肉、雞肉等肌肉組織,關(guān)于水產(chǎn)品中性激素多組分殘留測定方法的研究較少。Zhan等[15]建立了黃鱔肌肉中性激素測定的GC-MS方法。本文建立了魚制品中7種性激素多殘留測定的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法。采用甲醇提取、ZnCl2去脂、LC-C18和LC-NH2雙柱凈化、UPLC分離,以電噴霧離子源(ESI)為電離源,在正離子模式下采用多反應監(jiān)測(MRM)進行MS/MS檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

ACQU ITYTM超高效液相色譜儀(W aters公司),Q uattro Prem ier XE質(zhì)譜儀(W aters公司),超聲波清洗器(寧波海曙超聲儀器公司),R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BüCH I公司),TG16-WS高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司),SC-8L-150數(shù)控固相萃取儀(廣州智真生物科技有限公司),氮吹儀(上海安譜儀器公司)。LC-C18固相萃取柱(Supelco500m g,3mL),LC-NH2固相萃取柱(Supelco500m g,3mL)。甲醇為色譜純(M erck公司),甲酸為色譜純(含量為88%,天津光復精細化工研究院),實驗用水均為超純水(M illipore公司超純水器制備,電阻率為18.2MΩ·cm)。

性激素標準品:甲基炔諾酮(norgestrel)(Sigm a公司),甲基睪酮(m ethyltestosterone)、丙酸睪酮(testosterone p rop ionate)、醋酸甲羥孕酮(m edroxyp rogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮(m egestrol acetate)、醋酸氯地孕酮(chlorm adinone acetate)、諾龍(nandrolone)(D r.Ehrenstorfer Gm bH試劑),所有標準品純度均大于或等于98%。氘代諾龍(nandrolone-d3,內(nèi)標物)(Toronto Research Chemicals Inc.)。

標準溶液的配制:分別稱取標準品10.0m g,用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10mL棕色容量瓶中,以甲醇定容,得1g/L標準儲備液,于-18℃條件下保存。用甲醇稀釋1 000倍,得1m g/L標準溶液。

混合標準工作溶液的配制:以80%甲醇水溶液配制不同濃度的性激素混合標準工作溶液,標準工作溶液中內(nèi)標物的質(zhì)量濃度均為10μg/L。

酶解液:β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶(EC3.2.1.31+EC3.1.6.1,Helix pom atia,Sigm a-A ldrich,101 400units/mL)。

樣品:脫脂大黃魚和烤魚片,購于寧波市場。

1.2 U PLC-M S/M S條件

U PLC條件色譜柱:W aters ACQU ITYTMU PLC BEH-C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm);柱溫:40℃;樣品溫度:20℃;進樣體積:10μL。流動相A為含0.1%(體積分數(shù))甲酸的水,流動相B為含0.1%(體積分數(shù))甲酸的甲醇。梯度洗脫程序:5 m in內(nèi)由80%A線性降至10%A,保持5mm,然后在0.1m in內(nèi)升至80%A,保持2m in。

MS/MS條件離子模式:ESI+;毛細管電壓:3.00kV;錐孔電壓:40V;射頻透鏡1(RF len1)和射頻透鏡2(RF len2)的電壓分別為15.0V和13.0V;離子源溫度:100℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流量:600L/h;MRM模式;優(yōu)化的各性激素采集參數(shù)見表1。

1.3 試樣前處理

稱取已粉碎、均質(zhì)化的樣品5.0g(準確至0.1g),置于50mL具塞塑料離心管中(用于回收率試驗的樣品,此時加入一定量的標準溶液),加入0.2mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH5)10mL,再加入酶解液50μL,于37℃水浴振蕩器中酶解12 h。取出,冷至室溫,加入15mL甲醇超聲提取15 m in,于10 000r/m in下離心10m in,上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈離心管中;殘渣再以15mL甲醇重復提取1次。合并上清液,并向其中加入2g ZnCl2固體,攪拌至ZnCl2完全溶解,此時有沉淀析出,于10 000 r/m in下離心10m in,上清液轉(zhuǎn)入100mL雞心瓶中,加入5mL正丙醇溶液,于45℃、8kPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1mL,加入1mL甲醇超聲溶解后,再加入10mL水稀釋,待凈化。

預先以5mL甲醇、5mL水活化平衡LC-C18柱,然后將上述提取液全部加入該柱中;以5mL甲醇-水(體積比為10∶90)洗滌雞心瓶并作為淋洗液淋洗LC-C18柱,抽至近干后,下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2柱,再用6mL甲醇洗脫;將LCC18柱去掉后,以2mL甲醇洗脫LC-NH2柱,收集所有甲醇洗脫液并于50℃下用N2吹干;殘渣中加入1mL甲醇-水(體積比為80∶20),超聲溶解30s,漩渦混勻30s,過0.2μm濾膜,濾液供U PLC-MS/MS分析。

表1 7種性激素的質(zhì)譜采集參數(shù)Table1 M S p a ram e te rs for ana lysis of seven sex hormones

1.4 定性和定量分析

定性需滿足:(1)空白樣品中不出現(xiàn)與標準品相同的離子峰;(2)特征離子色譜峰的信噪比(S/N)都在3∶1以上;(3)試樣中目標物色譜峰的保留時間應與標準品的保留時間一致,容許偏差為±2.5%;(4)檢測離子的相對豐度與基質(zhì)匹配標準溶液對應離子的相對豐度一致,容許偏差滿足2002/657/EC中的要求。

采用標準溶液內(nèi)標法及基質(zhì)匹配外標法兩種方法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的確定

2.1.1 酶解條件的確定

研究發(fā)現(xiàn),部分性激素會與基質(zhì)中的蛋白質(zhì)結(jié)合,且以葡萄糖醛酸和硫酸共軛綴合物的結(jié)合態(tài)形式存在,故測定時應先將結(jié)合態(tài)的性激素釋放出來。B lasco等[13]發(fā)現(xiàn)肌肉中睪丸激素的結(jié)合態(tài)不足20%,而17β-雌二醇不足5%,檢測時可以忽略。但目前尚無魚制品樣品中結(jié)合態(tài)性激素所占比例大小的研究結(jié)果可供參考,為此,本實驗采用β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的混合酶制劑對樣品中可能存在的兩種結(jié)合態(tài)性激素進行酶解釋放。

2.1.2 去脂方法的選擇及條件優(yōu)化

在性激素測定的樣品前處理過程中,去脂方法的選擇尤為重要。一旦去脂效果不好將會導致后續(xù)過柱凈化過程中堵塞固相萃取柱,致使實驗無法進行。性激素殘留測定中最常用的去脂方法有正己烷去脂法[16,17]和冷凍離心去脂法[18]。由于性激素的極性并不是很大,在正己烷中有一定的溶解度,因而用正己烷去脂不可避免地會帶來部分損失。本文考察了冷凍離心去脂方法。該法對牛奶及肌肉樣品的去脂效果顯著,但采用該法對魚制品類樣品去脂,其提取液在凈化富集步驟中仍會堵塞固相萃取柱。馬萍等[19]利用卵磷脂可與二價金屬陽離子生成沉淀的原理提取純化雞蛋中的卵磷脂。魚制品中也含有磷脂類物質(zhì),在其樣品提取液中加入金屬離子不僅可以除去磷脂類物質(zhì),還可以起到沉淀蛋白質(zhì)的作用,因此本實驗以ZnC l2作為脂類及蛋白質(zhì)的沉淀劑。在ZnCl2的加入量考察實驗中發(fā)現(xiàn),當ZnC l2的加入量低于1.5g時,提取液仍然堵塞固相萃取柱;加入量為1.5g及更高時,凈化效果良好,ZnC l2加入量與各性激素提取效果之間的關(guān)系見圖1,從中可以看出,當ZnC l2加入量達到2g后對各性激素的提取影響并不顯著。考慮到后續(xù)處理及回收率,本實驗選擇ZnC l2加入量為2g。

2.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液流動相體系下,采用流動注射泵連續(xù)進樣模式進行了質(zhì)譜條件的優(yōu)化,確定了各化合物的錐孔電壓、碰撞電壓、離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、碰撞氣流量及定性定量離子等質(zhì)譜參數(shù),使樣液中每種性激素的離子化效率達到最佳,獲得的最佳質(zhì)譜條件如表1所示。

圖1 ZnC l2添加量對7種性激素提取效果的影響Fig.1 Effect of ZnC l2addition amoun t on seven sex hormone ex tractions

流動相的組成不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰形,最重要的是還會影響到離子化效率,從而影響靈敏度。實驗優(yōu)化了色譜流動相洗脫梯度,結(jié)果顯示,在1.2節(jié)條件下洗脫效果最好,圖2為在該條件下獲得的混合性激素標準溶液的MRM色譜圖。依據(jù)選定的條件,本文測試了空白脫脂大黃魚樣品提取液(見圖3,圖3中箭頭標示的位置為性激素的出峰位)和加標脫脂大黃魚樣品提取液(見圖4,圖4中涂黑峰為性激素的出峰位)中各激素定量離子的MRM色譜圖?？梢钥闯?樣品基質(zhì)不干擾7種性激素的測定。

2.3 檢出限和定量限

本文測定的是在全球范圍內(nèi)禁止使用的外源性激素,我們采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。圖4是空白樣品中添加1μg/kg時各性激素的MRM色譜圖?；趫D4,以3倍信噪比(S/N)對應的性激素濃度作為檢出限,以S/N=10對應的性激素濃度作為定量限,獲得各性激素的檢出限和定量限如表2所示。

圖2 7種性激素和內(nèi)標物混合標準溶液的M RM色譜圖Fig.2 M RM chromatograms of a mixed standard solution of seven sex hormones and internal standard

圖3 7種性激素空白脫脂大黃魚樣品的M RM色譜圖Fig.3 M RM chromatograms of all analytes in a blank degreasedlarge yellow croaker sample

表2 7種性激素的檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)(n=5)Table2 Limits of detection(LOD,S/N=3)and limits of quantification(LOQ,S/N=10)of seven sex hormones(n=5)

2.4 校準曲線、回收率及精密度

基質(zhì)效應是殘留檢測中普遍存在的現(xiàn)象,除了在樣品前處理過程中盡量凈化樣品外,消除基質(zhì)效應的常用方法還有兩種:一種是采取內(nèi)標法定量,一種是采用基質(zhì)匹配的標準溶液做校準曲線外標法定量。本實驗分別考察了上述兩種定量方法對測定結(jié)果的影響。

配制7種性激素質(zhì)量濃度均為1～40μg/L的系列混合標準溶液,以各性激素定量離子色譜峰面積與諾龍-d3的定量離子色譜峰面積之比乘以諾龍-d3的質(zhì)量濃度(Y)為縱坐標,性激素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標繪制得到內(nèi)標法校準曲線;配制7種性激素質(zhì)量濃度為1～40μg/L的系列混合基質(zhì)匹配標準溶液,以各性激素定量離子色譜峰面積(y)為縱坐標,性激素濃度(x)為橫坐標繪制得外標法校準曲線。由表3中數(shù)據(jù)可以看出,兩種定量方法中每種性激素校準曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99,表明各種性激素在質(zhì)量濃度為1～40μg/L內(nèi)均具有較好的線性關(guān)系。

圖4 脫脂大黃魚加標樣品的M RM色譜圖(每種性激素的加標水平均為1μg/kg)Fig.4 M RM chromatograms of adegreased large yellow croaker sample spiked with seven sex ho rm ones(spiked level of1μg/kg for each sex hormone)

表4是在目標性激素空白脫脂大黃魚樣品中添加水平為1μg/kg及4μg/kg時,以內(nèi)標法及外標法定量時的回收率及精密度數(shù)據(jù)?？梢钥闯?以內(nèi)標法定量時,平均回收率為76%～118%,相對標準偏差(RSD)為5.0%～11.3%;以基質(zhì)匹配外標法定量時,平均回收率為66%～94%,RSD為4.5%～10.7%。表明兩種定量方法均能夠滿足魚肉制品中性激素的檢測需要。用建立的方法對市售脫脂大黃魚及烤魚片進行檢測,未檢出7種目標違禁性激素。

表3 7種性激素的內(nèi)標法和外標法定量的線性方程(n=5)Table3 Calibration curves of seven sex hormones using in ternal and external standard methods(n=5)

表4 以內(nèi)標法和外標法定量空白樣品中添加7種性激素的回收率、相對標準偏差(RSD)(n=5)Table4 Recoveries and relative standard deviations(RSD)for seven sex hormones spiked in a blank sample using internal and external standard methods(n=5)

3 結(jié)語

本文詳細研究了測定魚制品中性激素多殘留檢測的樣品前處理方法,發(fā)現(xiàn)以ZnC l2沉淀去脂效果良好;優(yōu)化了超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時檢測多種外源性激素的條件;采用內(nèi)標法及基質(zhì)匹配外標法分別對魚制品中7種性激素進行多殘留同時檢測,均獲得了較好的效果,可根據(jù)實際情況選擇使用。

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Simultaneous determination of seven sex hormones in fish products using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

ZHANG Aizhi1,WANG Quanlin1＊,SHEN J ian1,ZHANG Shufen1,CHEN Liren2
(1.Ningbo Academy of Product Quality Supervision& Inspection,Ningbo 315041,China;2.Lanzhou Institute of Chem ica l Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0190-07

＊通訊聯(lián)系人:王全林,博士,教授級高級工程師,主要從事食品安全檢測技術(shù)及標準化研究.E-m ail:quanlinw ang@163.com.

浙江省質(zhì)檢系統(tǒng)重大科研計劃項目(20070106).

2009-06-09

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00190