王灼維, 彭福利, 王 媛, 童 維, 任 艷, 徐寧志, 劉斯奇＊

(1.中國科學(xué)院北京基因組研究所,北京101318;2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司,北京101318)

多維離子交換色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定在小鼠肝臟膜蛋白質(zhì)組分析中的應(yīng)用

王灼維1,2#, 彭福利1#, 王 媛1,2, 童 維1,2, 任 艷1,2, 徐寧志2, 劉斯奇1,2＊

(1.中國科學(xué)院北京基因組研究所,北京101318;2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司,北京101318)

膜蛋白質(zhì)在變性劑作用下能夠較充分地溶解。根據(jù)這一特點(diǎn),我們試圖在變性劑溶液中采用串聯(lián)離子交換色譜法分離小鼠肝臟膜蛋白質(zhì)。將小鼠肝臟膜蛋白質(zhì)溶解于含有4mol/L尿素,20mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH9.0)中,用Q-Sepharose FF和Sephacryl S-200HR樹脂組成的色譜柱結(jié)合大部分溶解的膜蛋白質(zhì),然后采用氯化鈉線性梯度洗脫蛋白質(zhì),分步收集后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)進(jìn)一步分離洗脫組分的蛋白質(zhì)。利用膠內(nèi)胰蛋白酶消化技術(shù)將SDS-PAGE膠內(nèi)分離的蛋白質(zhì)降解為相應(yīng)的肽段,然后以反相高效液相色譜分離和離子阱質(zhì)譜儀鑒定肽段。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和蛋白質(zhì)的功能分類,在所鑒定的392個(gè)蛋白質(zhì)中有306個(gè)可能為膜蛋白質(zhì)或膜結(jié)合蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的疏水性計(jì)算表明,GRAVY(grand average of hydropathicity)得分大于或等于0.00的蛋白質(zhì)有83個(gè)。綜上所述,我們有理由認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)方法基本符合小鼠肝臟膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究的要求。

多維離子交換色譜;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳;反相高效液相色譜;串聯(lián)質(zhì)譜;膜蛋白質(zhì);小鼠肝臟

Abstract:The analysis of membrane proteins is still a technical obstacle in p roteom ic investigation.A fundamental question is how to allow the hydrophobic proteins fully solubilizing in a p roper solvent environment.We propose that the denatured membrane proteins in high denaturant solution are fully ionized and separated through ion exchange Chromatography.The membrane proteins prepared from a mouse liver were dissolved in4mol/L urea,20mmol/L Tris-HCl buffer(pH9.0),and loaded onto a tandem Chromatography coup led with Q-Sepharose FF and Sephacryl S-200HR.with a linear NaCl gradient elution,the bound proteins were eluted and collected follow ed by sodium-dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDSPAGE)to further separate the eluted proteins.The protein bound on SDS-PAGE were excised and in-gel digested by trypsin,while the digested pep tides were delivered to reversed-phase high performance liquid Chromatography(HPLC)and ion-trap mass spectrometry for the peptide identifications.O f a total of392proteins identified,306were membrane proteins or membrane associated proteins reported by literature.B ased on the calculation of hydrophobicity,the GRAVY(grand average of hydropathicity)scores of83p roteins are over or equal to0.00.Taking all the evidence,we have established an effective approach which is feasible in the investigation towards mouse liver membrane proteomics.

Key words:multidimensional ion-exchange Chromatography;sodium-dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE);reversed-phase high perform ance liquid Chromatography(RP-HPLC);tandem mass spectrometry(MS/MS);membrane protein;mouse liver

質(zhì)膜是細(xì)胞與其生長環(huán)境相隔離的物理屏障[1]。質(zhì)膜上存在的多種蛋白質(zhì)在細(xì)胞間的相互作用、信號傳導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2,3]。例如,質(zhì)膜蛋白質(zhì)廣泛參與藥物靶標(biāo)的識別,大約70%已知的藥物靶點(diǎn)都存在于質(zhì)膜上[4]。值得注意的是,幾乎所有的藥物都在肝臟中進(jìn)行修飾和降解。因此,鑒定肝臟膜蛋白質(zhì)將為設(shè)計(jì)治療用單克隆抗體和小分子藥物提供有價(jià)值的靶標(biāo)信息[5]。

膜蛋白質(zhì)的研究是一件富有挑戰(zhàn)性的工作,尤其以膜蛋白質(zhì)的分離技術(shù)最為困難。所有的膜蛋白質(zhì)都具有很強(qiáng)的疏水性,幾乎不溶于水溶液[6]。去污劑能夠助溶膜蛋白質(zhì),但也只是使膜蛋白質(zhì)與去污劑分子形成均勻懸浮于溶液的微膠粒(micelle),而在這種情況下,蛋白質(zhì)可能喪失生物活性或者無法進(jìn)一步分離純化[7]。另一個(gè)困擾研究者的問題是如何使膜蛋白質(zhì)在長期實(shí)驗(yàn)操作中保持溶解狀態(tài)。在很多情況下,膜蛋白質(zhì)能夠很好地溶解于某種溶液,而在另一種溶液中則發(fā)生沉淀,這也是在多步實(shí)驗(yàn)操作中丟失膜蛋白質(zhì)的主要原因。為了避免這類問題的發(fā)生,鳥槍法(Shotgun)的蛋白質(zhì)酶消化技術(shù)被廣泛地采用[8]。它使我們所面對的待分離對象不再是蛋白質(zhì),而是酶消化之后的多肽,這樣就能有效地避免膜蛋白質(zhì)在多步實(shí)驗(yàn)中的丟失。然而,這種方法又帶來了另外一些技術(shù)問題,這些問題在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中顯得尤為突出。鳥槍法處理之后會(huì)產(chǎn)生數(shù)量龐大的多肽,這意味著液相色譜的分離容量必須成千百倍地提高。事實(shí)上,盡管反相色譜有很好的多肽分離能力,但直到今天它仍無法完成復(fù)雜多肽的有效分離[9]。多維色譜是一種提高色譜分離效率的較佳途徑。問題是,隨著分離步驟的復(fù)雜化,多肽的損失也相應(yīng)地增加,特別是在不同緩沖體系的變換過程中,肽段的損失更加嚴(yán)重。另一個(gè)問題也值得我們注意:膜蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的豐度較低,如果它們不能得到相對的富集,其肽段信號可能在分離和鑒定的過程中被稀釋或抑制[10]。鑒于上述考慮,在采用鳥槍法進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析時(shí),應(yīng)針對膜蛋白質(zhì)的特征設(shè)計(jì)相對應(yīng)的合理實(shí)驗(yàn)流程。一般而言,膜蛋白質(zhì)分離應(yīng)遵守以下3點(diǎn)原則:(1)選用溶解能力強(qiáng)的緩沖溶液,最大限度地溶解膜蛋白質(zhì);(2)選擇前后一致的溶劑體系,以保持膜蛋白質(zhì)的溶解狀態(tài);(3)盡可能在分離過程中最大程度地富集蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了膜蛋白質(zhì)分析的研究。已有多篇有關(guān)膜蛋白質(zhì)組分析的報(bào)道。B londer等[11]采用兩種去垢劑Triton X-100或B rij-96提取大鼠嗜堿性粒細(xì)胞的膜蛋白質(zhì),并結(jié)合16O/18O交換和同位素親和標(biāo)簽(ICAT)標(biāo)記的方法定量測定了所鑒定的蛋白質(zhì)。他們認(rèn)為,Triton X-100比B rij-96有更好的溶解能力。在Fandino等[12]建立的新方法中,膜蛋白質(zhì)首先被非變性膠所分離以避免在電泳過程中蛋白質(zhì)在疏水區(qū)凝集,然后將染色的蛋白質(zhì)區(qū)帶在膠內(nèi)與胰蛋白質(zhì)酶共孵育,消化后的肽段采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的方法加以鑒定。在本文中,我們提出了一種新的分析膜蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方案。與前人做法不同的是,我們首先采用含有變性劑的緩沖液提取小鼠肝組織膜組分中的膜蛋白質(zhì),并在同一溶劑條件下利用串聯(lián)離子交換色譜分離變性的膜蛋白質(zhì),并運(yùn)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)一步分離各個(gè)離子交換柱的洗脫組分,最后結(jié)合膠內(nèi)胰酶消化和LC-MS鑒定各區(qū)帶中的蛋白質(zhì)。分析數(shù)據(jù)表明,在所鑒定的392個(gè)蛋白質(zhì)中有306個(gè)可能為膜蛋白質(zhì)或膜結(jié)合蛋白質(zhì);疏水性評估指出,83個(gè)蛋白質(zhì)的GRAVY(grand average of hydropathicity)得分大于0.00,是典型的疏水蛋白質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

鹽酸胍、尿素、硫脲、蛋白質(zhì)酶抑制劑cocktail、三氯乙酸(TCA)、四甲基乙二胺(TEM ED)、甘氨酸、苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙腈和考馬斯亮藍(lán)R-250等購于Sigm a-A ldrich公司(Steinhe im,Germ any)。SDS、過硫酸銨和所有色譜填料(均為6%瓊脂糖交聯(lián)球體,粒徑為45～165μm)購于Am ersham B iosciences公司(Uppsala,Sw eden)。胰蛋白質(zhì)酶和二硫蘇糖醇(D TT)購于Prom ega(M adison,USA)。其他所用試劑的純度均為分析純或高于分析純。

Agilent1100型液相色譜儀(安捷倫公司),LCQ Deca XP離子阱質(zhì)譜(熱電公司),AKTA液相系統(tǒng)(通用電氣公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠肝組織膜組分的制備

實(shí)驗(yàn)用小鼠(C57BL/6J,7～9周,北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)均在無菌條件下飼養(yǎng),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合中國科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)。小鼠用戊巴比妥鈉麻醉,摘取肝臟,將其切成約3mm3的小塊并轉(zhuǎn)入離心管中;用預(yù)冷的磷酸緩沖液反復(fù)洗滌3次,除去多余的血液成分而后將離心管迅速放入液氮中冷凍保存,備用。1g肝臟組織用5mL的勻漿液(50mmol/L甘露糖,200mmol/L蔗糖,2 mmol/L二乙胺四乙酸(ED TA),1mmol/L PMSF,0.2mmol/L N a2VO3,1mmol/L N aF,蛋白質(zhì)酶抑制劑cocktail,10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4))重新懸浮。用玻璃勻漿器勻漿3次,差速離心提取膜組分。離心方法分別為400g,10m in,取上清液;800g,10m in,取上清液;10 000g,15 m in,取上清液;150 000g,60m in,去上清液,沉淀即為肝臟組織細(xì)胞的膜組分。用勻漿液重新懸浮沉淀,反復(fù)洗滌兩次,除去殘留的其他細(xì)胞組分。

1.2.2 不同緩沖體系提取膜蛋白質(zhì)

我們采用了6種不同的膜蛋白質(zhì)提取緩沖液并檢測其提取效率。6種膜蛋白質(zhì)提取緩沖液分別為:(1)7mol/L尿素和2mol/L硫脲,pH9.0;(2)6mol/L鹽酸胍,pH9.0;(3)7mol/L尿素、2 mol/L硫脲和4.5mol/L鹽酸胍,pH9.0;(4)3.5 mol/L尿素,1mol/L鹽酸胍和5%SDS,pH9.0;(5)7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4.5mol/L鹽酸胍和2mol/L N aOH,pH13.5;(6)8mol/L尿素,pH11.0。分離的小鼠肝組織膜組分分別用這6種緩沖液重新懸浮,超聲3m in,室溫靜置1h充分溶解膜蛋白質(zhì)。于40 000g下離心20m in,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中,用2-D QUAN T KIT(Am ensham B iosciences)測定蛋白質(zhì)濃度。每種緩沖液提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)不少于3次,每個(gè)樣品都重復(fù)測定蛋白質(zhì)濃度2次。將(5)號緩沖液作為檢驗(yàn)其他幾種緩沖液提取膜蛋白質(zhì)能力的參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 幾種離子交換樹脂對蛋白質(zhì)結(jié)合能力的比較

對8種不同的離子交換樹脂對蛋白質(zhì)的結(jié)合能力進(jìn)行了比較。8種樹脂分別為:⑴D EAE-Sepharose FF;⑵Q-Sepharose FF;⑶CM-Sepharose FF;⑷SP-Sepharose FF;⑸D EAE-Sepharose FF和CM-Sepharose FF;⑹D EAE-Sepharose FF和CM-SepharoseFF;⑺Q-SepharoseFF和SPSepharose FF;⑻Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF。其中⑴、⑵、⑸、⑺樹脂采用緩沖液Ⅰ(20 mmol/L Tris-HC l,4mol/L尿素,pH9.0),⑶、⑷、⑹、⑻樹脂采用緩沖液Ⅱ(20mmol/L醋酸鈉,4 mol/L尿素,pH6.0)浸泡。將膜蛋白質(zhì)與泡脹的樹脂混合,置于室溫下30m in使蛋白質(zhì)與樹脂充分結(jié)合。于2 000g下離心10m in,取上清液測定蛋白質(zhì)濃度,計(jì)算結(jié)合前后樣品中蛋白質(zhì)總量的比率,得出樹脂的蛋白質(zhì)結(jié)合效率。

1.2.4 串聯(lián)離子交換液相色譜分離膜蛋白質(zhì)

串聯(lián)液相色譜采用裝有Sephacryl S-200HR和Q-Sepharose FF樹脂的色譜柱(1cm×40cm)。樹脂在流動(dòng)相A(20mmol/L Tris-HCl和4mol/L尿素,pH9.0)中泡脹平衡充分后,先將Sephacryl S-200HR填入柱床約16cm,壓實(shí)后再填入QSepharose FF樹脂10cm。填好的柱用流動(dòng)相A以12mL/h的流速充分平衡。上樣10m g膜蛋白質(zhì),用流動(dòng)相B(20mmol/L Tris-HCl、1mol/L N aCl和4mol/L尿素,pH9.0)平衡,梯度洗脫柱上結(jié)合的蛋白質(zhì)。洗脫液中氯化鈉溶液的線性梯度為0.2mol/L至1mol/L。

1.2.5 SDS-PAGE分離膜蛋白質(zhì)

將收集到的膜蛋白質(zhì)分別與電泳上樣緩沖液混合,于95℃下加熱3m in使蛋白質(zhì)充分還原和變性。用12%的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)R-250染色,每個(gè)泳道切成7份用于胰蛋白質(zhì)酶消化。

1.2.6 胰蛋白質(zhì)酶膠內(nèi)消化膜蛋白質(zhì)

將凝膠條帶用含有50%乙腈的碳酸氫銨溶液(25mmol/L)脫色,而后用D TT(10mmol/L,36℃,1h)和碘乙酰胺(IAM)(55mmol/L,室溫,避光,45m in)還原烷基化。用含有50%乙腈的碳酸氫銨溶液(25mmol/L)洗滌條帶,乙腈脫水,用SpeedVac離心濃縮系統(tǒng)充分干燥。加入25μL胰蛋白質(zhì)酶(10ng/μL,25mmol/L碳酸氫銨緩沖液),于37℃下過夜消化;加入含有50%乙腈和2.5%TFA的水溶液(終止液),充分混勻,從膠中抽提消化得到的多肽。

1.2.7 高效液相色譜分離消化后的多肽

多肽混合物用毛細(xì)管反相色譜柱(150mm×150mm,C18,5μm,孔徑30nm,M icroTech公司)梯度洗脫分離。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液,流速為2 μL/m in,洗脫梯度為2%B-80%B線性梯度,洗脫時(shí)間為80m in。

1.2.8 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)

色譜分離后的多肽經(jīng)電噴霧離子化,用離子阱質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)定為:噴霧電壓3.2 kV,離子傳輸管150℃,掃描的范圍為m/z400～2 000,碰撞能量為35%。得到的數(shù)據(jù)用SEQU EST軟件搜索,數(shù)據(jù)庫為IPI(International Protein Index)的小鼠數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.htm l)[13]。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)的平行性用平均值±SD表示。組間差異做Student’s t-檢驗(yàn),p<0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同緩沖液對膜蛋白質(zhì)提取效率的比較

采用6種不同的緩沖液從小鼠肝臟組織膜組分中提取蛋白質(zhì),膜組分與緩沖液充分混勻后,經(jīng)40 000g離心,收集上清液,只發(fā)現(xiàn)很少的未溶解物質(zhì)。膜蛋白質(zhì)提取效率見表1。從表1可見,除了單獨(dú)使用8mol/L尿素提取的膜蛋白質(zhì)明顯偏低外,其余5種緩沖液的提取效率無明顯差別。pH值是影響膜蛋白質(zhì)提取效率的關(guān)鍵因素。當(dāng)pH降到7.0時(shí),在提取液中出現(xiàn)明顯的沉淀;pH為6.0時(shí),幾乎損失40%的膜蛋白質(zhì);pH低至3.0時(shí),損失55%的膜蛋白質(zhì)。從表1還可見,當(dāng)緩沖液中尿素濃度達(dá)到7mol/L時(shí),已經(jīng)能夠取得較好的提取效果。經(jīng)還原烷基化后,尿素濃度稀釋至4mol/L時(shí)也不會(huì)發(fā)生沉淀?？紤]到緩沖液中高濃度變性劑對樹脂的損傷,在后續(xù)試驗(yàn)中均采用較低濃度的尿素(4mol/L)緩沖液。

表1 不同緩沖液提取膜蛋白質(zhì)的提取效率Table1 Extraction yields of the membrane proteins with different buffers

2.2 不同離子交換樹脂結(jié)合膜蛋白質(zhì)能力的比較

在評價(jià)離子交換樹脂對膜蛋白質(zhì)的結(jié)合能力時(shí),兩個(gè)因素需要優(yōu)先考慮:一是溶液中較低pH可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的沉淀,所以陽離子交換樹脂不是一個(gè)理想的選擇;二是胍基對蛋白質(zhì)結(jié)合陰離子交換樹脂的干擾,即使胍基低至100mmol/L的濃度都會(huì)影響蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合,因而應(yīng)盡量降低緩沖液中胍基的濃度。

我們比較了8種不同的離子交換樹脂對膜蛋白質(zhì)的結(jié)合容量,結(jié)果列于表2。表2數(shù)據(jù)顯示,在測試的幾種離子交換樹脂中,Q-Sepharose FF具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合能力。我們進(jìn)行了混合樹脂對膜蛋白質(zhì)結(jié)合能力的測試,結(jié)果表明:(1)在使用等體積樹脂的條件下,混合樹脂并未表現(xiàn)出比單一樹脂更好的結(jié)合能力;(2)雖然在廠家的推介中Q-Sepharose有著極高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力(120HSA m g/mL),但本實(shí)驗(yàn)中該樹脂對膜蛋白質(zhì)的結(jié)合能力僅為45m g/mL;(3)上樣時(shí)間和上樣膜蛋白質(zhì)的濃度對膜蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合有很大的影響,延長孵育時(shí)間和降低膜蛋白質(zhì)濃度都能夠明顯改善膜蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合。我們測試了膜蛋白質(zhì)濃度與樹脂結(jié)合膜蛋白質(zhì)效率的關(guān)系,結(jié)果見圖1。如圖1所示,10m g膜蛋白質(zhì)與0.1mL樹脂相混合,只有45%的膜蛋白質(zhì)能夠結(jié)合于柱上;0.5m g膜蛋白質(zhì)與0.1mL樹脂相混合,幾乎所有(97.87%)膜蛋白質(zhì)都能結(jié)合于柱上。根據(jù)這一結(jié)果,我們在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以0.1mL Q-Sepharose樹脂結(jié)合0.5m g膜蛋白質(zhì)的比例上樣進(jìn)行離子交換色譜。

表2 離子交換樹脂對膜蛋白質(zhì)的結(jié)合能力Table2 B ind ing capacities of different resins for the membrane proteins

圖1 Q-Sepharose FF樹脂與膜蛋白質(zhì)結(jié)合能力的分析Fig.1 Capacity of Q-Sepharose FF binding to the membrane proteins

圖2 離子交換樹脂/SDS-PAGE分離膜蛋白質(zhì)Fig.2 Separations of the membrane p rote ins using ion exchange chromatography/SDS-PAGE

2.3 液相色譜對膜蛋白質(zhì)的分離

將Q-Sepharose FF裝填至1根柱體積10mL的色譜柱管中用于分離膜蛋白質(zhì),以波長280nm的光吸收檢測柱后流出蛋白質(zhì),并采用自動(dòng)收集器收集洗脫的膜蛋白質(zhì)組分(見圖2a)。由圖2a可見,該色譜柱的分離效率較差,膜蛋白質(zhì)在一個(gè)較小的鹽濃度范圍內(nèi)被洗脫出來(氯化鈉濃度約為0.25 mol/L)。將Sephacryl S-200HR樹脂裝填至1根柱體積為30mL的色譜柱管中用于分離膜蛋白質(zhì),該色譜柱對相對分子質(zhì)量(Mr)在10 000～100 000范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)有較好的分離,然而對膜蛋白質(zhì)的分離效率很差(見圖2b)。這個(gè)結(jié)果是可以理解的,因?yàn)榕抛枭V無法同時(shí)達(dá)到富集和分離蛋白質(zhì)的雙重目的。此外,我們還用乙腈梯度洗脫的方法對用疏水介質(zhì)Pheny-Sepharose FF裝填的色譜柱進(jìn)行了測試,結(jié)果仍無法令人滿意(結(jié)果略)。

為了充分利用不同色譜材料的特性,在分離蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)揮各自優(yōu)點(diǎn)而避免自身的不足,我們填裝了一個(gè)串聯(lián)色譜柱。如前所述,這個(gè)串聯(lián)色譜柱由Sephacryl S-200HR和Q-Sepharose FF兩種樹脂組成。蛋白質(zhì)首先通過離子交換色譜分離,而后再通過凝膠色譜分離,分離結(jié)果見圖2c;與單一樹脂相比,串聯(lián)色譜柱對蛋白質(zhì)的分離效果有了明顯的提高;隨著氯化鈉濃度的升高,出現(xiàn)了3個(gè)很寬的洗脫峰。

2.4 SDS-PAGE對膜蛋白質(zhì)的分離

經(jīng)串聯(lián)離子交換色譜分離且分管收集后的膜蛋白質(zhì)在4mol/L尿素緩沖液中相當(dāng)穩(wěn)定。為了防止溶液更換引起膜蛋白質(zhì)的沉淀,我們采用SDSPAGE進(jìn)一步分離這些收集組分的蛋白質(zhì)。由圖2所示,SDS-PAGE能夠較好地分離膜蛋白質(zhì),而且SDS-PAGE圖譜還表明每個(gè)收集組分中的蛋白質(zhì)組成明顯不同,意味著串聯(lián)離子交換色譜有較好的分離效果。在本實(shí)驗(yàn)中,我們收集所有洗脫及未結(jié)合的組分,并用SDS-PAGE加以鑒定以確定相鄰收集組分中蛋白質(zhì)的重疊程度,這樣可以簡化下一步蛋白質(zhì)鑒定的復(fù)雜度。

2.5 多肽混合物的反相高效液相色譜分離及離子阱質(zhì)譜鑒定

將每個(gè)SDS-PAGE的電泳泳道均勻地切割成7個(gè)區(qū)帶,采用膠內(nèi)胰蛋白酶完全消化的方法降解區(qū)帶內(nèi)的蛋白質(zhì),所產(chǎn)生的肽段用反相高效液相色譜分離,分離后的肽段直接進(jìn)入離子阱質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定分析。圖3a為一張離子阱質(zhì)譜的總離子流圖;圖3b是圖3a中保留時(shí)間為45.15m in組分的一級質(zhì)譜譜圖;圖3c是母離子為m/z651.78的二級質(zhì)譜譜圖。一般而言,每個(gè)區(qū)帶平均采集到2 497個(gè)二級質(zhì)譜譜圖。通過SEQU EST搜索共鑒定出392個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。相鄰條帶間鑒定蛋白質(zhì)的重疊率為21.34%(數(shù)據(jù)未展示)。鑒定得到的蛋白質(zhì)的相關(guān)信息詳見附表1(http://www.chrom-China.com/qikan/m anage/w enzhang/2009060755.pdf)。

圖3 高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用鑒定膜蛋白質(zhì)Fig.3 Iden tifications of the m em b rane p rote ins fraction by HPLC-ion trap M S/M S

2.6 鑒定蛋白質(zhì)的性質(zhì)分析

通過GO-slim(http://www.geneontology.org/)分類、文獻(xiàn)檢索以及grand average of hydropathicity軟件(GRAVY score,http://ca.expasy.org/tools/p rotparam.html),我們對所鑒定的蛋白質(zhì)是否為膜蛋白質(zhì)進(jìn)行了理論預(yù)測分析。在分析中,如果任一被鑒定的蛋白質(zhì)滿足如下一個(gè)條件即可認(rèn)為它是膜蛋白質(zhì)或膜結(jié)合蛋白質(zhì):(1)GO-slim功能分類;(2)文獻(xiàn)報(bào)道;(3)GRAVY計(jì)算得分大于0。根據(jù)這個(gè)策略,在所鑒定的392個(gè)蛋白質(zhì)中有306個(gè)屬于膜蛋白質(zhì)或者膜結(jié)合蛋白質(zhì)(見附表1),其中19.3%(59/306)基于功能分類,55.9%(171/306)基于文獻(xiàn)報(bào)道,24.8%(76/306)GRAVY得分大于0。詳細(xì)信息見附表2(網(wǎng)址同附表1)。分類的結(jié)果表明,大約78%的鑒定蛋白質(zhì)可歸于膜組成蛋白質(zhì)。由此可見,利用超速離心制備的肝組織質(zhì)膜基本符合蛋白質(zhì)組分析的要求?；谛∈蠡蚪M數(shù)據(jù)和GO-slim分析,將306個(gè)膜或膜結(jié)合蛋白質(zhì)分成9類(見圖4a)。圖4a表明,與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)占最大比例(37.58%,115/306),其次是與生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)(32.03%,98/306),再次是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(10.78%,33/306),其他的為未分類蛋白質(zhì)(7.52%,23/306)、膜受體/信號和細(xì)胞粘連蛋白質(zhì)(6.21%,19/306)、分泌蛋白質(zhì)(3.27%,10/306)、抗凋亡蛋白質(zhì)(0.98%,3/306)、運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)(0.98%,3/306)、水解酶/輔助因子(0.65%,2/306)。蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)是決定蛋白質(zhì)能否嵌入雙層質(zhì)膜的關(guān)鍵因素。目前國際上較為廣泛地采用GRAVY score來評價(jià)膜蛋白質(zhì)組[14]。在對蛋白質(zhì)的GRAVY得分的統(tǒng)計(jì)分析(見圖4b)中,大于或等于0,-0.1,-0.2和-0.5的蛋白質(zhì)數(shù)分別為83,130,199和265。以蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)作為橫軸,Mr作為縱軸,虛擬蛋白質(zhì)在雙向電泳凝膠上的分布(見圖4c),可發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)主要分布于p I4～12、Mr低于120 000的范圍內(nèi)。

圖4 所鑒定的蛋白質(zhì)的性質(zhì)Fig.4 Characterizations of the identified proteins

3 討論

膜蛋白質(zhì)組分析的困難在于方法學(xué)上的限制。早期的蛋白質(zhì)組研究的重要手段是雙向電泳,但這項(xiàng)技術(shù)只適合于親水性蛋白質(zhì)的分離,對于疏水的膜蛋白質(zhì)的分離基本上是失敗的。近年來一些研究者采用不同的去垢劑溶解膜蛋白質(zhì),然后在去垢劑存在的條件下開展等電聚焦分離疏水蛋白質(zhì)。這些努力固然取得了一些進(jìn)步,但是距離完全分離膜蛋白質(zhì)的目標(biāo)還相差很遠(yuǎn)。鳥槍法較好地避免了疏水蛋白質(zhì)的水溶性難題,提高了膜蛋白質(zhì)鑒定的效率。但是問題也接踵而來。首先,鳥槍法著重于肽段的鑒定,卻無法獲得完整蛋白質(zhì)的信息。對于膜蛋白質(zhì)而言,大部分以多聚物形式嵌于膜內(nèi),局部的肽段信息無法體現(xiàn)膜蛋白質(zhì)的真實(shí)狀態(tài)。其二,膜蛋白質(zhì)常處在修飾狀態(tài),例如磷酸化或糖基化等,部分的肽段鑒定也無法提供修飾蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確信息。本文研究的基本出發(fā)點(diǎn)就是要在傳統(tǒng)的電泳法和鳥槍法之間尋找一種可能的折中的實(shí)驗(yàn)方案。一方面,我們希望有可能較為有效地分離完整的膜蛋白質(zhì);另一方面,我們又要利用鳥槍法的優(yōu)勢盡可能多地鑒定膜蛋白質(zhì)?；谶@種考慮,我們在本文研究中進(jìn)行了兩項(xiàng)技術(shù)革命。其一,我們通過不同變性劑濃度的測試,尋找最佳的膜蛋白質(zhì)溶解濃度。其中3個(gè)因素至關(guān)重要:(1)在一定變性劑濃度下膜蛋白質(zhì)應(yīng)有較大的溶解度;(2)胰蛋白酶在此變性劑濃度中能夠保持足夠的水解活性;(3)樹脂在此變性劑濃度下仍然具備理想的離子交換能力。最終我們確定4mol/L尿素緩沖液和陰離子交換樹脂是小鼠肝臟膜蛋白質(zhì)分離較為合適的液相色譜體系。其二,我們比較了各種離子交換樹脂對膜蛋白質(zhì)的結(jié)合能力,鑒于各種樹脂單獨(dú)使用都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),我們提出樹脂的串聯(lián)裝填方法,以充分利用各個(gè)樹脂各自的分離優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)證明,我們采用Sephacryl S-200HR和Q-Sepharose FF串聯(lián)色譜可獲得相當(dāng)有效的分離效果。這兩項(xiàng)技術(shù)革命將有利于膜蛋白質(zhì)組方法學(xué)發(fā)展。在未來的研究中,我們將從色譜柱的微量化著手,力圖使含量低的膜蛋白質(zhì)也能在同樣的工作系統(tǒng)中得到分離。

利用較高的分辨率和峰容量的串聯(lián)離子交換色譜技術(shù),我們成功地從小鼠肝臟中分離和鑒定了306個(gè)膜蛋白質(zhì)。在所鑒定的蛋白質(zhì)中,有多個(gè)能量代謝和呼吸鏈相關(guān)的膜蛋白質(zhì),如ATP synthase、ATP-citrate synthase、N a+/K+-ATPase、Cytochrom e C、NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S p rotein和Cytochrom e P450[15]。我們也鑒定到了一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白質(zhì),如lam inin recep tor、RER1p rotein和reticulum calcium ATPase2[16]等。值得注意的是,在所鑒定的蛋白質(zhì)中的確有一部分蛋白質(zhì)并非經(jīng)典的膜蛋白質(zhì),如脂代謝和核糖體蛋白質(zhì),fatty acid transport p rotein和long chain fatty acid CoA ligase等[17,18],去毒性物質(zhì)酶類,cadherin和glutathione S-transferase等[19,20]。這種現(xiàn)象表明,有一些胞漿蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜的聯(lián)系是相當(dāng)密切的,利用超速離心方法完全分離膜蛋白質(zhì)和膜結(jié)合蛋白質(zhì)實(shí)際上很困難。為了獲取較多的膜嵌合蛋白質(zhì),采用低濃度的去垢劑處理膜的制備物將可能清除一些膜結(jié)合蛋白質(zhì)。從這些結(jié)果中我們也得到啟示,這些胞漿蛋白質(zhì)可能需要與細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)相互作用才能發(fā)揮其生物功用。

4 結(jié)論

在4mol/L尿素溶液中,采用串聯(lián)離子交換色譜法能夠有效分離小鼠肝臟膜蛋白質(zhì)。將洗脫成分進(jìn)一步用SDS-PAGE分離并采用胰蛋白酶完全消化所分離的蛋白質(zhì),以反相高效液相色譜分離肽段,以離子阱質(zhì)譜儀鑒定肽段和蛋白質(zhì)。在所鑒定的392個(gè)蛋白質(zhì)中,306個(gè)可預(yù)測為膜蛋白質(zhì)或膜結(jié)合蛋白質(zhì)。本研究提供了一種新型的、操作簡易的膜蛋白質(zhì)組分析方法。

[1] Josic D,Clifton J G.Proteom ics,2007,7(16):3010

[2] Dorm eyerW,van Hoof D,B raam S R,et al.J Proteom e Res,2008,7(7):2936

[3] Tan S,Tan H T,Chung M C,et al.Proteom ics,2008,8(19):3924

[4] Hopkins A L,Groom C R.Ernst Schering Res Found W orkshop,2003(42):11

[5] Overbye A,Fengsrud M,Seglen P O.Autophagy,2007,3(4):300

[6] ChevalletM,Santoni V,Poinas A,et al.Electrophoresis,1998,19(11):1901

[7] Henningsen R,Gale B L,Straub K M,et al.Proteom ics,2002,2(11):1479

[8] Rietschel B,Arrey T N,Meyer B,et al.Mol Cell Proteom ics,2008,8(5):1029

[9] W olters D A,washburn M P,Yates J R3rd.Anal Chem,2001,73(23):5683

[10] Prinz T,Muller J,Kuhn K,et al.J Proteom e Res,2004,3(5):1073

[11] B londer J,Yu L R,Radeva G,et al.J Proteom e Res,2006,5(2):349

[12] Fandino A S,Rais I,Vollm er M,et al.J mass Spectrom,2005,40(9):1223

[13] Kersey P J,Duarte J,W illiam s A,et al.Proteom ics,2004,4(7):1985

[14] Fischer F,W olters D,R?gnerM,et al.MCP,2006,5(3):444

[15] Lee H J,Kw on M S,Lee E Y,et al.Proteom ics,2008,8(11):2168

[16] Hw ang Y Y,LiM D.Proteom ics,2006,6(10):3138

[17] Zhang H,Fan X,Bagshaw R,et al.methods mol B iol,2008,432:229

[18] Riezm an H.Cell,2007,130(4):587

[19] Schum aker L,N ikitakis N,Goloubeva O,et al.Clin Cancer Res,2008,14(18):5877

[20] Clifton J G,Li X,ReutterW,et al.J Chromatogr B,2007,849(1/2):293

Analysis of mouse liver membrane proteins using multidimensionalion exchange chromatography
and tandem mass spectrometry

WANG Zhuow ei1,2#,PENG Fuli1#,WANG Yuan1,2,TONG W ei1,2,REN Yan1,2,XUN ingzhi2,LIU Siqi1,2＊
(1.Beijing Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 101318,China;2.Beijing Protein Innovation,Beijing 101318,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0115-08

＊通訊聯(lián)系人:劉斯奇,研究員,博士生導(dǎo)師.Tel:(010)80485324,E-m ail:siqiliu@genom ics.org.cn.

國家高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)項(xiàng)目(No.2006AA02A308)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30700378).

2009-12-18

#并列第一作者.

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00115