譚培藝，高衛(wèi)真，康 毅，焦建杰，婁建石，劉艷霞

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津 300070）

血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)膜表面的單層扁平細(xì)胞，通過產(chǎn)生和分泌許多血管活性物質(zhì)，在維持血管舒縮、抗凝血及血管構(gòu)建等方面起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)與多種疾病關(guān)系的重要方法。牛胸主動(dòng)脈來源充足、取材經(jīng)濟(jì)、操作方便，已成為血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的主要材料。以往采用酶消化法[1]分離，消化時(shí)間不好把握，步驟冗繁，且容易污染。本實(shí)驗(yàn)擬采用機(jī)械刮取法分離牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（CTAECs），旨在建立簡單、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性強(qiáng)，適用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞培養(yǎng)方法，為血管內(nèi)皮細(xì)胞功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 屠宰場檢疫合格的成年黃牛，雌雄不限。

1.1.2 試劑 南美胎牛血清購自美國Hyclone公司。DMEM（含葡萄糖5.5mmol/L）液體培養(yǎng)基購自北京天潤善達(dá)生物科技有限公司。0.25%胰酶-EDTA購自美國Gibco公司。兔抗牛Ⅷ因子抗體及FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CTAECs的分離 剛剛宰殺的成年黃牛，上端從主動(dòng)脈弓端，下端至膈的主動(dòng)脈裂孔處，完整分離胸主動(dòng)脈，用含有慶大霉素（8萬U/L）的PBS液4℃無菌保存，6~8 h內(nèi)可用。操作前將主動(dòng)脈血管置于消毒托盤中，剪去主動(dòng)脈外膜附著脂肪，用上述PBS液沖洗3次去除血污后迅速移入超凈工作臺(tái)，縱向剪開血管，將其截成長約8 cm的組織塊，分塊置于培養(yǎng)皿中，再次用PBS液清洗。用無菌手術(shù)刀在每個(gè)組織塊內(nèi)表面輕輕刮取若干次，后移入事先裝有DMEM完全培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，葡萄糖 5.5mmol/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100mg/ml）的培養(yǎng)瓶中。注意刀片在培養(yǎng)液中輕晃幾次，使刮取下的細(xì)胞與培養(yǎng)液均勻混合。采用“力度梯度標(biāo)記”法探索刮取力度，第一次獲取細(xì)胞的過程中，按照刮取力度不同在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記1~10，數(shù)字越大力度越大，接種完畢，取1滴細(xì)胞懸液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)每瓶細(xì)胞成活率的不同探索最佳刮取力度，在此后的實(shí)驗(yàn)中便可進(jìn)行批量操作。最后將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞。以后每3 d換液1次，至細(xì)胞融合鋪滿瓶底。

1.2.2 CTAECs的純化 若培養(yǎng)瓶中見有內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞同時(shí)貼壁生長，需對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行純化，方法如下：倒置相差顯微鏡（Olympus CK40-F200）下確定平滑肌細(xì)胞團(tuán)的準(zhǔn)確位置，標(biāo)記于瓶底。倒掉瓶內(nèi)培養(yǎng)液，將尖頭吸管探入瓶內(nèi)，以標(biāo)記處為中心貼瓶底螺旋形旋轉(zhuǎn)，破壞平滑肌細(xì)胞團(tuán)，PBS液沖洗脫落細(xì)胞3次。重新注入DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 CTAECs的傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞生長融合達(dá)80%以上時(shí)可進(jìn)行傳代。棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)液，PBS液清洗細(xì)胞3次，加入0.25%胰酶-EDTA混合消化液鋪滿瓶底,置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育約7min，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓，開始漂浮移動(dòng)時(shí)加入含血清DMEM完全培養(yǎng)液4~6ml終止消化，用尖頭吸管吹打制成細(xì)胞懸液。將瓶內(nèi)培養(yǎng)液收集于離心管內(nèi)，1 000 r/min，離心5min，棄上清。再重新注入DMEM完全培養(yǎng)液6~10ml，尖頭吸管吹打制成細(xì)胞懸液，按1∶2或1∶3比例將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，逐日細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4 CTAECs的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定：利用倒置相差顯微鏡對原代和傳代血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)觀察。（2）Ⅷ因子間接免疫熒光檢測：將培養(yǎng)在蓋玻片上的內(nèi)皮細(xì)胞及對照組血管平滑肌細(xì)胞用95%乙醇，5%乙酸固定15min后滴加入兔抗牛第Ⅷ因子抗原診斷血清37℃孵育1 h，或4℃過夜。PBS沖洗，吸干后加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清，37℃孵育30min。PBS沖洗，吸干后滴加9∶1的純甘油-PBS封片。熒光顯微鏡檢查，內(nèi)皮細(xì)胞可見細(xì)胞核周呈黃綠色發(fā)亮熒光環(huán)。而平滑肌細(xì)胞無此熒光環(huán)，是為陰性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 CTAECs生長曲線 1~3 d細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，4~6 d進(jìn)入穩(wěn)定生長期，7~9d進(jìn)入生長平臺(tái)期（圖1）。

2.2 牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下，牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈多角形、短梭形，核仁顯著，呈圓形或橢圓形。在接種24 h后貼壁生長，2~3 d有細(xì)胞從組織塊鉆出（圖2），10 d左右細(xì)胞融合成單層，如“鋪路石”樣鑲嵌排列（圖3）。傳代細(xì)胞生長旺盛，有時(shí)可見多核細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)證實(shí)，活細(xì)胞的百分比為93.7%。

2.3 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定 牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色可見細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內(nèi)可見黃綠色顆粒，核周密集（圖4）。證明培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞形成機(jī)體內(nèi)一個(gè)龐大的內(nèi)分泌組織，其特殊的解剖學(xué)部位使內(nèi)皮細(xì)胞能敏感的感知血流、壓力、炎癥信號(hào)以及血液循環(huán)中激素水平的變化，通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)過程與鄰近及遠(yuǎn)處的細(xì)胞相互聯(lián)系，對各種應(yīng)激作出反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。牛胸主動(dòng)脈血管取材方便，來源豐富，與人體動(dòng)脈血管非常相似，并且內(nèi)表面積大，較人臍靜脈可操作性強(qiáng)，是建立內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的良好材料。

在培養(yǎng)細(xì)胞的獲取上，現(xiàn)主要有機(jī)械法[2]和酶消化法。酶消化法是利用酶液對內(nèi)皮表面進(jìn)行消化，收集消化液經(jīng)離心棄上清等操作獲取細(xì)胞[3]，此法消化時(shí)間不好掌握，步驟冗繁，容易污染。胰蛋白酶消化能力不強(qiáng),且有細(xì)胞毒性；膠原酶雖消化效果好，但價(jià)格昂貴，不適合實(shí)驗(yàn)室批量應(yīng)用。本研究經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，改良后的機(jī)械刮取法，克服了以往刮取法中細(xì)胞純度不夠以及酶消化法冗繁昂貴的缺點(diǎn)，是一個(gè)行之有效的內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。刮取法的力度選擇是一個(gè)難點(diǎn)，刮取力度不夠獲取的細(xì)胞太少，刮取力度過大又會(huì)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的混入，因此我們采用“力度梯度標(biāo)記法”探索刮取力度。第一次獲取細(xì)胞的過程中，按照刮取力度由輕到重可在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記1~10，數(shù)字越大力度越強(qiáng)。或者將探索時(shí)的刮取力度分為輕、中、重3個(gè)水平，分別標(biāo)記于細(xì)胞培養(yǎng)瓶上，根據(jù)每瓶細(xì)胞成活率的情況探索出最佳的刮取力度，在此后的實(shí)驗(yàn)中便可以此力度作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行批量操作。每次原代培養(yǎng)可制備10瓶左右細(xì)胞，熟練操作后，成活率可達(dá)60%以上。實(shí)驗(yàn)證明，探索合適刮取力度后，內(nèi)皮細(xì)胞的純度可達(dá)90%，把操作步驟簡單化，細(xì)胞成活率最大化，大大降低污染概率，使內(nèi)皮細(xì)胞體外批量培養(yǎng)成為可能。但刮取法不可避免偶會(huì)混入平滑肌細(xì)胞，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶內(nèi)混有平滑肌細(xì)胞團(tuán)，可在倒置相差顯微鏡下找到細(xì)胞團(tuán)，用記號(hào)筆在瓶身處標(biāo)記其準(zhǔn)確位置，待倒掉瓶內(nèi)培養(yǎng)液后，將無菌尖頭吸管探入瓶內(nèi)相應(yīng)位置，以標(biāo)記點(diǎn)為中心進(jìn)行螺旋形涂抹，PBS液沖洗3遍去除脫落細(xì)胞，重新注入DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。此法可有效去除雜細(xì)胞，瓶內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞生長不受影響。

培養(yǎng)液的配置是CTAECs體外培養(yǎng)成功的另一個(gè)關(guān)鍵所在[4]。首先，培養(yǎng)基含糖量要求為5.5mmol/L，高低濃度的葡萄糖含量都可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[5]，使細(xì)胞出現(xiàn)空泡等不良狀態(tài)，降低CTAECs的成活率。其次，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高質(zhì)量的血清對內(nèi)皮細(xì)胞的生長有良好的促進(jìn)作用，我們在實(shí)驗(yàn)中選用南美血源的胎牛血清，占培養(yǎng)液20%的比例進(jìn)行培養(yǎng)，極大促進(jìn)了原代細(xì)胞的貼壁和傳代細(xì)胞的成活率，在不添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的情況下，可傳7~10代，細(xì)胞生長狀況良好。傳代后細(xì)胞增殖速度明顯加快，此時(shí)可將血清比例降為10%對增殖速度進(jìn)行控制。最后，正確選擇傳代時(shí)機(jī)，可提高內(nèi)皮細(xì)胞的成活率，傳代過遲造成細(xì)胞凋亡；傳代過頻，引起細(xì)胞變異和損傷[6]。

標(biāo)本材料的新鮮程度也影響獲得內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。有研究表明，動(dòng)脈血管離體后，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)一些物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生變化。如離體超過6 h，內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原釋放量以及前列環(huán)素生長量均隨著存放時(shí)間的延長而下降[7]。本實(shí)驗(yàn)于1 h內(nèi)完成原代分離培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量多增殖速度快。

牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞相對于其他血管內(nèi)皮易分離取得，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。應(yīng)用改良后的機(jī)械刮取法可成功獲得大量牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，為體外研究建立血管內(nèi)皮提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸檫M(jìn)一步研究血管內(nèi)皮的生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

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