胡功鈴，陳國(guó)平，胡宗利，顧峰，李勇

重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030

植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白在擬南芥等十字花科植物春化作用途徑中的功能

胡功鈴，陳國(guó)平，胡宗利，顧峰，李勇

重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030

春化低溫處理可以使擬南芥等十字花科植物提前開花，該過程中涉及到一個(gè)重要的植物同源結(jié)構(gòu)域指(PHD-finger)蛋白VERNALIZATION INSENSITIVE 3(VIN3)。PHD-finger結(jié)構(gòu)域是真核生物中一種進(jìn)化保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，通常參與蛋白質(zhì)之間的相互作用，特別是對(duì)核小體組蛋白進(jìn)行甲基化、乙?；?、磷酸化等修飾。在春化處理過程中，VIN3及其同源基因編碼的蛋白都具有PHD-finger結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過對(duì)開花抑制基因FLOWERING LOCUS C染色質(zhì)組蛋白進(jìn)行H3K9、H3K27甲基化、H3K9和H3K14去乙酰化等修飾，調(diào)節(jié)FLC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，使其從松弛狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨饶s狀態(tài)而關(guān)閉其功能，從而影響FLC轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)開花。以下綜述了擬南芥等十字花科植物春化作用途徑中PHD-finger蛋白的功能，并且概述了春化作用機(jī)制。

植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白，VIN3，F(xiàn)LOWERING LOCUS C，春化作用，組蛋白修飾

Abstract:Vernalization makes Arabidopsis and other cruciferous plants flowering earlier.During this process, an important plant homeodomain-finger(PHD-finger)protein named VIN3 is involved.The PHD domain was a conserved zinc-finger domain in eukaryotic organism.It used to take part in the interaction between proteins, especially the modification on histone of nucleosome,such as methylation, acetylation and phosphorylation.In vernaliazation pathway, the proteins translated by VERNALIZATION INSENSITIVE 3(VIN3)and homologous genes could result in methylation on H3K9 and H3K27 and deacetylation on H3K9 and H3K14 on chromatin histone of FLOWERING LOCUS C, a gene that inhibited flowering.The structure state of FLC would be changed from relaxation into compression.Then the transcription activity of FLC could be restrained and it couldn’t inhibit flowering any more, so it would induce flowering earlier.This paper reviewed the function of PHD-finger proteins in vernalization pathway in Arabidopsis and other cruciferous plants, and overviewed the vernalization mechanism.

Keywords:plant homeodomain-finger proteins, VIN3, FLOWERING LOCUS C, vernalization, histone modification

目前，本實(shí)驗(yàn)室在研究菜薹Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilissen.et Lee 早花原因的過程中發(fā)現(xiàn)春化處理(Vernalization)可以使菜薹提前開花10～20 d。根據(jù)擬南芥Arabidopsis及其蕓薹屬相關(guān)領(lǐng)域的研究報(bào)道，本研究將重點(diǎn)放在開花網(wǎng)絡(luò)核心基因FLOWERING LOCUS C(FLC)及其春化作用途徑上游的關(guān)鍵基因 VERNALIZATION INSENSITIVE 3(VIN3)上。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間(大于20 d)的低溫處理會(huì)誘導(dǎo)VIN3的表達(dá)，并使FLC表達(dá)量降低，此時(shí)菜薹的表型為早花。在模式植物擬南芥中很早前就有過這種現(xiàn)象的相關(guān)報(bào)道，并且對(duì)VIN3有較深入的研究。VIN3編碼一個(gè) PHD-finger蛋白，在春化作用中起著重要的作用。近年來，對(duì)PHD-finger蛋白在擬南芥春化作用途徑中的功能已有了一些報(bào)道。以下簡(jiǎn)要介紹PHD-finger結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能，并主要介紹 VIN3及其同源基因編碼的PHD-finger蛋白在擬南芥等十字花科植物春化作用途徑中的功能。

1 植物開花的多種途徑

成花是高等植物個(gè)體發(fā)育的中心環(huán)節(jié)，是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)的一個(gè)重要生理過程。環(huán)境因素對(duì)這個(gè)過程具有很大的影響，春化作用便是其中一個(gè)重要因素[1]。所謂春化作用，是指對(duì)植物進(jìn)行低溫處理促進(jìn)其開花的過程。對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，影響開花的因素主要有4種途徑：光周期途徑、赤霉素途徑、自主途徑和春化作用途徑[2]。其中，光周期途徑和赤霉素途徑通過激活開花整合基因FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1(SOC1)促進(jìn)植物開花[3-4]。自主途徑和春化作用途徑通過抑制FLOWERING LOCUS C(FLC)的表達(dá)促進(jìn)開花(圖1)。FLC編碼 MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，通過抑制 FT和SOC1的表達(dá)抑制植物開花[2]。

依賴春化作用的開花途徑是指植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段必須經(jīng)過一定時(shí)期的低溫才能獲得向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的潛能，在適宜條件下開花。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，春化低溫處理誘導(dǎo)了春化作用關(guān)鍵基因VIN3的表達(dá)[5]。VIN3編碼一個(gè)PHD-finger蛋白，對(duì)開花抑制基因FLC起負(fù)調(diào)控作用[5]。VIN3只在長(zhǎng)時(shí)間低溫處理?xiàng)l件下才能被誘導(dǎo)表達(dá)，在植株返回常溫條件后則無法再檢測(cè)出VIN3，但FLC仍呈現(xiàn)被抑制狀態(tài)[5]，此時(shí)對(duì)FLC的抑制需要VERNALIZATION 1(VRN1)和VERNALIZATION 2(VRN2)等基因的維持。VIN3對(duì)FLC的抑制效應(yīng)主要是通過其編碼的PHD-finger蛋白對(duì)FLC染色質(zhì)組蛋白H3K9和H3K27的甲基化以及H3K9和H3K14的去乙?；揎梉5]，使FLC的染色質(zhì)從松弛狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨饶s狀態(tài)而關(guān)閉FLC功能，最終抑制其表達(dá)。

2 PHD結(jié)構(gòu)域的序列、結(jié)構(gòu)及其功能

春化處理誘導(dǎo)了關(guān)鍵基因VIN3的表達(dá)，其編碼一種PHD鋅指蛋白。真核生物中的許多蛋白質(zhì)包含鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)，這類蛋白稱為鋅指蛋白。鋅指蛋白包含特殊的指狀結(jié)構(gòu)，在對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和RNA的識(shí)別和結(jié)合中起重要作用[6]。PHD鋅指結(jié)構(gòu)域是14種已知的鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc-binding motif)中的一種，存在于 400多種真核生物蛋白質(zhì)中，在進(jìn)化過程中高度保守[7]。1993年，Schinder等在研究擬南芥蛋白HAT3.1和HOXIA時(shí)發(fā)現(xiàn)了一段富含半胱氨酸的保守序列，而這段序列與金屬離子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域非常相似[8]，這段區(qū)域就是PHD結(jié)構(gòu)域。

圖1 擬南芥的多種開花調(diào)控途徑Fig.1 Pathways regulating flowering time in Arabidopsis.Lines with arrows indicate activation of gene expression and lines with bars for gene repression.

PHD結(jié)構(gòu)域是一類由約60個(gè)氨基酸殘基組成的具有 C4HC3(cys4-His-cys3)保守序列的結(jié)構(gòu)(圖2)，屬于“cross-brace”鋅指蛋白家族(Cross-brace zinc finger protein)[9]。從擬南芥以及蕓薹屬中克隆獲得的VIN3及其同源VEL家族基因編碼的氨基酸序列中都含有PHD結(jié)構(gòu)域，并且具有保守的C4HC3序列結(jié)構(gòu)(圖2)。其中，BrVIN3(Ten Bank Accession No.FJ936115)基因片段為本實(shí)驗(yàn)室首次從蕓薹屬中獲得，與AtVIN3(Ten Bank Accession No.NM_125121.3)有很高的同源性，且表達(dá)模式類似，并且其編碼的氨基酸序列中含有保守的PHD結(jié)構(gòu)域。PHD結(jié)構(gòu)可以結(jié)合2個(gè)鋅離子，以pygoupus蛋白為例，分別在C1、C2、H1和 C5上結(jié)合第一個(gè)鋅離子以及 C3、C4、C6和C7上結(jié)合第2個(gè)鋅離子，使得在PHD結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成2個(gè)環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[10]。本研究推測(cè)菜薹中的PHD-finger蛋白VIN3也具有與pygoupus蛋白類似的鋅蛋白交叉支架結(jié)構(gòu)(圖3)。該結(jié)構(gòu)使得VIN3具有很多生理功能，例如參與蛋白與蛋白之間的相互作用、核小體組蛋白的修飾等。

圖2 不同蛋白質(zhì)PHD結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of PHD finger sequences among different proteins.Asterisk means the C4HC3 conservative structure.

圖3 BrVIN3蛋白PHD結(jié)構(gòu)域的cross-brace模型預(yù)測(cè)Fig.3 Anticipation of cross-brace model of the PHD-finger of BrVIN3, based on the cross-brace model of the PHD-finger of Pygous[11].

各種PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的PHD三維結(jié)構(gòu)大致相同，為球狀結(jié)構(gòu)域。但隨不同PHD結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基序列的差異，其三維結(jié)構(gòu)也會(huì)有細(xì)微差異，正是這種差異性，賦予了PHD結(jié)構(gòu)域家族成員不同的生物學(xué)功能。例如，原癌蛋白c-Cbl 和MEKK1(MAP kinase/ERK kinase kinase)的PHD結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶活性，介導(dǎo) ERK1/2的泛素化和降解[12]；WSTF、KAP-1、Mi-2β以及AIRE等PHD鋅指蛋白在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)，推測(cè)這類鋅指可能通過其 loop2表面與特異的核蛋白相互作用，從而參與染色質(zhì)重塑的調(diào)控[6]。此外，PHD結(jié)構(gòu)域能夠特異性識(shí)別并結(jié)合組蛋白H3K4的甲基化密碼(修飾)，從而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。在擬南芥的春化作用途徑中，涉及到VIN3等PHD-finger蛋白對(duì)FLC染色質(zhì)組蛋白的修飾，而這種修飾參與了開花關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控，與開花時(shí)間有密切的聯(lián)系。同樣，在蕓薹屬中，本實(shí)驗(yàn)室首次克隆了BrVIN3，由于BrVIN3與AtVIN3具有較高的同源性，進(jìn)而推測(cè)VIN3也參與了FLC組蛋白的修飾，并且具有與AtVIN3類似的功能。

3 春化作用途徑中的PHD-finger蛋白及其功能

目前，對(duì)于擬南芥中春化作用的分子機(jī)理已經(jīng)有較深入的研究，但對(duì)其表觀遺傳機(jī)制尚不十分明確。近年來，對(duì)于FLC染色質(zhì)組蛋白的修飾有較多的報(bào)道，組蛋白的修飾與春化作用促進(jìn)開花是密切相關(guān)的。FLC在擬南芥的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐位置(圖1)，在其上游基因FRIGIDA(FRI)等的正調(diào)控作用下抑制成花[13]。研究表明，F(xiàn)LC的表達(dá)水平與植株低溫處理的時(shí)間呈量的關(guān)系，低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，則FLC的表達(dá)越弱[14]。FLC染色質(zhì)的組蛋白上發(fā)生了許多共價(jià)修飾[9]，這些修飾與FLC的轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān)，這就涉及到了“組蛋白密碼”理論。

3.1 組蛋白密碼

染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位——核小體由DNA和4種組蛋白(Histone)H2A、H2B、H3和H4構(gòu)成。每一種組蛋白各2個(gè)分子，形成一個(gè)組蛋白八聚體，約200 bp的DNA分子盤繞在組蛋白八聚體構(gòu)成的核心結(jié)構(gòu)外面，這就形成了一個(gè)核小體。核心組蛋白八聚體中央是由組蛋白H3和H4形成的異四聚體，側(cè)翼是組蛋白H2A和H2B形成的異二聚體。每個(gè)組蛋白的氨基端約20～35個(gè)富含基本氨基酸的片段延伸到核小體的表面稱為“組蛋白尾”(Histone tail)[15]。組蛋白尾在空間結(jié)構(gòu)上相對(duì)可變，由于與核內(nèi)各種蛋白質(zhì)或酶直接接觸而被修飾，包括乙?；⒘姿峄?、甲基化、泛素化等(圖4)[16]。經(jīng)過修飾的組蛋白，可以改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)而促使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑，參與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控。

當(dāng)染色質(zhì)處于高度凝縮狀態(tài)時(shí)，該染色質(zhì)上的基因就可能不表達(dá)，但當(dāng)染色質(zhì)處于松弛狀態(tài)時(shí)，該基因就可以作為模板而被轉(zhuǎn)錄表達(dá)[17]。在組蛋白上發(fā)生特定的共價(jià)修飾后，可以引起基因位點(diǎn)染色質(zhì)狀態(tài)的改變，從而影響基因的表達(dá)水平。一旦組蛋白被修飾之后，特定的共價(jià)修飾可以被特異性的綁定蛋白識(shí)別，而這些綁定蛋白可以招募一些激活或者抑制基因表達(dá)的復(fù)合物使得染色質(zhì)形成更高層次的結(jié)構(gòu)，再通過細(xì)胞傳代使該結(jié)構(gòu)得以維持[9]，從而保持激活或抑制靶基因的穩(wěn)定狀態(tài)，這就是組蛋白密碼理論。在春化作用途徑中，涉及到FLC染色質(zhì)組蛋白的甲基化、乙?；刃揎?，而這些修飾與VIN3等PHD-finger蛋白密切相關(guān)。

3.2 春化作用途徑中的關(guān)鍵 PHD-finger蛋白對(duì)FLC染色質(zhì)組蛋白的修飾

3.2.1 春化處理前FLC染色質(zhì)組蛋白H3K4的甲基化和H3K9、H3K14的乙?；?/h4>

圖4 各種組蛋白尾的修飾[16]Fig.4 Post-translation modifications of the histone tails[16].P: phosphorylation; Ac: acetylation; Me: methylation; Ub: ubiquitin.

未經(jīng)春化處理時(shí)，開花抑制基因 FLC的表達(dá)處于較高水平，這與其染色質(zhì)上H3K4的三甲基化有很直接的關(guān)系。H3K4的甲基化一般以3種狀態(tài)存在：?jiǎn)渭谆⒍谆腿谆痆18]。研究發(fā)現(xiàn)，H3K4的三甲基化可以激活基因的表達(dá)[19]。在酵母中，RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合因子PAF1復(fù)合物與RNA聚合酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄過程中結(jié)合，招募 H3K4甲基化轉(zhuǎn)移酶 SET1與目的基因結(jié)合，使其在轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域的 5′端三甲基化，從而使三甲基化水平上升[18]。在擬南芥中，與酵母中 PAF1復(fù)合物功能類似的同源基因分別為EARLY FLOWERING 7(ELF7)、EARLY FLOWERING 8(ELF8)、VERNALIZATION INDEPENDENCE 4(VIP4)，與酵母中 SET1甲基化酶作用類似的為EARLY FLOWERING IN SHORT DAYS(EFS)基因，推測(cè)酵母與擬南芥中H3K4的甲基化機(jī)制是相似的。在elf7和elf8突變體中，F(xiàn)LC染色質(zhì)組蛋白的甲基化水平降低，表現(xiàn)為早花，這說明PAF1類復(fù)合物是FLC染色質(zhì)組蛋白 H3K4三甲基化所必需的[20]。H3K4的二甲基化也可以激活基因的表達(dá)[19]。在酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，某些轉(zhuǎn)錄基因(如 MET16)染色質(zhì)組蛋白H3K4的甲基化要求Isw1p(酵母ATP水解產(chǎn)物，染色質(zhì)重塑蛋白)的參與[21]。在擬南芥中，功能與其類似的基因?yàn)镻IE1，該基因是FLC表達(dá)所必需的[18]。PIE1可能通過綁定H3K4等修飾位點(diǎn)引起FLC染色質(zhì)的重塑，提高其表達(dá)水平進(jìn)而抑制植物成花。

此外，在未春化處理植株中，組蛋白 H3K9和H3K14的乙?；３州^高的水平，可以促進(jìn)FLC的表達(dá)[1]。核心組蛋白 N端的末端富含賴氨酸，生理?xiàng)l件下帶正電，它可與帶負(fù)電的DNA或相鄰的核小體發(fā)生作用，導(dǎo)致核小體構(gòu)象緊湊及染色質(zhì)高度折疊，該狀態(tài)下FLC不表達(dá)或者表達(dá)很弱。乙酰化使組蛋白與 DNA間的作用減弱從而導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象松散，這種構(gòu)象有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的接近并結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，在未春化處理時(shí)，F(xiàn)LC在特定甲基化和乙?；膮f(xié)同作用下保持高水平表達(dá)。

3.2.2 春化處理后FLC染色質(zhì)組蛋白H3K9、H3K27的甲基化和H3K9、H3K14的去乙?；?/h4>

對(duì)擬南芥的研究表明，經(jīng)過春化處理后，F(xiàn)LC染色質(zhì)組蛋白 H3K9、H3K27的二甲基化和三甲基化水平升高，植株表現(xiàn)為早花。該過程依賴于關(guān)鍵基因VIN3，VIN3具有感受低溫時(shí)程的特性。冬性一年生擬南芥只有經(jīng)過足以產(chǎn)生春化效應(yīng)的一段時(shí)期的低溫處理后，VIN3才會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，一般時(shí)間為20 d[5]。如處理時(shí)間不夠，VIN3不會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，也就不會(huì)產(chǎn)生下游的春化效應(yīng)。當(dāng)VIN3被誘導(dǎo)表達(dá)后，F(xiàn)LC的表達(dá)隨即被抑制，因而VIN3的作用是在春化過程中識(shí)別低溫處理的時(shí)間進(jìn)而建立對(duì)春化關(guān)鍵基因 FLC表達(dá)的抑制[22]。VIN3編碼一個(gè)PHD-finger蛋白，可以參與核小體組蛋白的甲基化、去乙?；刃揎?，引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑。VIN3被誘導(dǎo)后，F(xiàn)LC染色質(zhì)組蛋白上的H3K9和H3K27發(fā)生二甲基化和三甲基化，同時(shí)，H3K4的三甲基化和H3K36的甲基化消失[23]，該機(jī)制目前尚不清楚。此外，F(xiàn)LC所在染色質(zhì)的組蛋白H3發(fā)生了去乙酰化，包括 H3K9、H3K14 的去乙?；揎梉5]。去乙?；螅現(xiàn)LC染色質(zhì)重新回到高度凝縮狀態(tài)使其表達(dá)受到抑制。

Sung等在擬南芥中克隆了 VERNALIZATION 1(VRN1)、VERNALIZATION 2(VRN2)和 VIN3 基因，探索它們與FLC染色質(zhì)組蛋白修飾的關(guān)系[5]。研究發(fā)現(xiàn)，VIN3在受長(zhǎng)時(shí)間低溫處理后被誘導(dǎo)，表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加而增加，同時(shí)FLC隨著VIN3的增加而遞減?；謴?fù)常溫后VIN3隨即消失，F(xiàn)LC仍然呈現(xiàn)被抑制的效應(yīng)，這與VRN1和VRN2密切相關(guān)[5]。研究表明，VRN1和VRN2不受低溫的誘導(dǎo)，為組成型表達(dá)。VRN1編碼一種植物特有的DNA結(jié)合蛋白[24]，VRN2編碼與果蠅S(U)12同源的polycomb蛋白[25]，VRN1和VRN2參與FLC的后生抑制。在該2個(gè)基因的突變體中，春化作用對(duì)冬性一年生植物沒有明顯的促進(jìn)開花作用，并且在低溫處理產(chǎn)生春化效應(yīng)時(shí)，F(xiàn)LC的表達(dá)量明顯降低，但是在植株恢復(fù)常溫后，F(xiàn)LC的表達(dá)迅速升高，表現(xiàn)為未春化的狀態(tài)，這充分說明了VRN1和VRN2參與VIN3對(duì)FLC抑制作用的維持。春化處理使FLC的第一個(gè)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū) H3K9和 H3K27二甲基化水平增加。其中VRN1參與H3K9的二甲基化修飾，VRN2參與H3K9和 H3K27的二甲基化修飾[5]，VRN2與Polycomb-group(Pc-G)蛋白組成一個(gè)類 PRC2蛋白復(fù)合體(PRC2-like complex)，從而參與春化過程中對(duì)FLC的后生性抑制。此外，H3K9的甲基化對(duì)植物產(chǎn)生春化效應(yīng)非常重要。在vrn1的突變體中，沒有發(fā)現(xiàn)H3K9的甲基化，雖然春化過程中FLC染色質(zhì)上H3K27的甲基化水平仍然在不斷升高，但卻不能維持對(duì)FLC的穩(wěn)定抑制。由此表明，植物主要是通過H3K9的甲基化來建立對(duì)春化效應(yīng)的調(diào)控[9]。

擬南芥中還存在一些與VIN3同源的基因：VIL1(VIN3-like1，又名 VRN5)、VIL2(VEL1)、VIL3(VEL2)和VIL4(VEL3)，屬于VEL家族基因[26]，它們編碼的蛋白都具有類似的PHD關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域(圖2)，參與對(duì)FLC表達(dá)的調(diào)控。其中VIL1在春化作用過程中與 VIN3形成一個(gè)異源二聚體，進(jìn)而參與春化介導(dǎo)的對(duì)FLC染色質(zhì)的去乙?；虷3K9、H3K27的三甲基化修飾[27-28]。從經(jīng)春化處理的擬南芥中分離到了一個(gè)包括PRC2復(fù)合體、VIN3、VIL1以及VIL2的大復(fù)合體(PHD-PRC2復(fù)合體)，這說明PRC2復(fù)合體還與VIN3及其相關(guān)蛋白VIL1一起組成一個(gè)大蛋白復(fù)合體，參與抑制FLC的表達(dá)[26]。此外，VIL1與 FLC染色質(zhì)組蛋白 H3K27的三甲基化的延伸有密切聯(lián)系。春化處理后，在FLC的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和翻譯起始位點(diǎn)之間，H3K27三甲基化水平增加，但第一個(gè)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)的H3K27三甲基化都沒有明顯的增加。然而，在植株處于22℃條件下時(shí)，發(fā)現(xiàn) H3K27三甲基化的區(qū)域向 FLC的啟動(dòng)子區(qū)和第一個(gè)內(nèi)含子、編碼區(qū)延伸，并且第一內(nèi)含子上的三甲基化水平最高[29]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LC染色質(zhì)上結(jié)合的VIL1與H3K27三甲基化水平有一致的變化，這說明三甲基化范圍的延伸與VIL1有著密切的聯(lián)系。VIL3的表達(dá)也受長(zhǎng)時(shí)間低溫的誘導(dǎo)，它可能與VIL1形成異二聚體在葉片中參與春化介導(dǎo)的對(duì)FLC的后生性抑制[26]。目前，VIL2和VIL4的功能尚不清楚。

3.3 春化作用機(jī)制-FLC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑

根據(jù)組蛋白密碼理論，可以較全面地概述春化作用的機(jī)制。在低溫春化處理之前，植株內(nèi)本身存在H3K4的三甲基化，該三甲基化信號(hào)可以被PAF1復(fù)合物與EFS的結(jié)合物所識(shí)別，從而引導(dǎo) RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合于FLC的5′端序列上，起始FLC的轉(zhuǎn)錄，激活FLC的表達(dá)[20]。此外，開花抑制因子PIE1可以識(shí)別 H3K4甲基化并與之結(jié)合，穩(wěn)定染色質(zhì)的構(gòu)象[18]，并且在SWR1復(fù)合體(可以參與FLC染色質(zhì)組蛋白H3的乙酰化、H3K4的三甲基化修飾)以及FRI(結(jié)合在 FLC啟動(dòng)子區(qū)域)的共同作用下維持FLC高水平表達(dá)(圖5)。經(jīng)過冬天長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理，VIN3被誘導(dǎo)表達(dá)。VIN3編碼蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別染色質(zhì)上的組蛋白修飾，除了以上闡述的甲基化修飾外，VIN3還參與對(duì) FLC染色質(zhì)的去乙?；揎棥Ｔ趘in3突變體與野生型植株的研究中，野生型植株在 VIN3表達(dá)后，F(xiàn)LC染色質(zhì)組蛋白H3K9、H3K14發(fā)生了去乙酰化，而突變體中沒有這一現(xiàn)象，所以認(rèn)為 VIN3也是 FLC染色質(zhì)組蛋白H3K9、H3K14的去乙?；匦璧腫22]。此外，VIN3/VIL1及VIL2/PRC2復(fù)合體形成PHD-PRC2大復(fù)合體，對(duì)FLC染色質(zhì)上進(jìn)行H3K9和H3K14去乙酰化、H3K9和H3K27二甲基化以及轉(zhuǎn)錄起始和翻譯起始位點(diǎn)之間 H3K27三甲基化等組蛋白修飾，引起FLC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在空間上的改變，使得EFS無法靠近FLC染色質(zhì)，因而不能發(fā)生H3K4三甲基化。PAF1復(fù)合物因無法找到 H3K4三甲基化信號(hào)而不能激活FLC的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)FLC轉(zhuǎn)錄的抑制[29]。在VRN1、VRN2和其他蛋白(如LHP1[30]，其是維持FLC沉默所必需的)的共同作用下使得這種抑制得以維持(圖5)，F(xiàn)LC表達(dá)的關(guān)閉導(dǎo)致下游受FLC抑制的開花促進(jìn)基因(FT和SOC1等)的表達(dá)水平升高，最終促進(jìn)開花。

圖5 春化作用機(jī)制示意圖Fig.5 Schematic diagram of the vernalization mechanism.The left picture means FLC was in activation state before vernalization, and the right means FLC has been repressed after a long time of cold treatment.

4 其他物種春化作用途徑中的PHD-finger蛋白

除了擬南芥中報(bào)道的 VIN3、VIL1(VRN5)等PHD-finger結(jié)構(gòu)域蛋白外，F(xiàn)u等從小麥 Triticum monococcum L.中克隆得到了 VIN3的 3個(gè)同源基因：TmVIL1、TmVIL2和TmVIL3，它們編碼的蛋白也具有PHD結(jié)構(gòu)域保守的C4HC3的基序特性(圖2)。這3個(gè)基因與擬南芥中報(bào)道的VIN3極其相似，有較高的同源性，并也受春化的正調(diào)控。在恢復(fù)常溫條件后，小麥 VIL基因的表達(dá)水平回到未春化處理的水平[31]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥的VIL基因保留了與擬南芥VIN3/VIL同系物相似的特征及其轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控模式，說明它們可能具有類似的功能。

此外，水稻Oryza sativa中也獲得了4個(gè)VEL家族的基因：OsVIL1、OsVIL2、OsVIL3和OsVIL4，與擬南芥已報(bào)道的AtVIN3、AtVIL1、AtVIL2和AtVIL3以及小麥中的VEL家族相比，它們編碼的蛋白都含有保守的 PHD結(jié)構(gòu)域[31]，所以推測(cè)水稻中的 VIL家族蛋白也具有組蛋白的修飾以及染色質(zhì)的重塑等功能。

5 結(jié)語(yǔ)

植物開花是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，它涉及多種基因、多條途徑以及多種信號(hào)的參與。春化低溫處理作為誘導(dǎo)開花的一個(gè)重要因子，與開花網(wǎng)絡(luò)的其他途徑共同作用，促進(jìn)植物開花。目前，對(duì)春化作用的研究已經(jīng)不僅僅局限于擬南芥，在蕓薹屬、小麥等物種中都有比較深入的研究。本實(shí)驗(yàn)室首次獲得了蕓薹屬中的VIN3片段，并且發(fā)現(xiàn)該基因片段與擬南芥AtVIN3具有很高的同源性，具有類似的表達(dá)模式，這更加豐富了VIN3/VEL家族基因在不同物種中的功能研究。在擬南芥和禾本科植物中的VIN3/VEL家族蛋白都具有保守的PHD結(jié)構(gòu)域，這對(duì)認(rèn)識(shí)PHD-finger蛋白的功能及其在春化途徑中的作用是至關(guān)重要的。近些年來，人們對(duì)于春化作用的分子機(jī)制研究有了很大進(jìn)展，但對(duì)于春化作用的上游調(diào)控，特別是VIN3感受低溫時(shí)程而表達(dá)和失去低溫信號(hào)關(guān)閉的機(jī)制以及低溫信號(hào)的接受和傳遞等過程還不清楚。在植物中，E3泛素蛋白連接酶SINAT5與FLC共定位在核小體中，其鋅指模序直接作用于FLC的MADS-box區(qū)，把FLC作為其泛素連接酶活性的底物，參與FLC的泛素降解途徑[32]。同時(shí)也有報(bào)道FLC染色質(zhì)上發(fā)生了磷酸化修飾，可以影響FLC活性[33]。PHD-finger蛋白有沒有涉及到FLC染色質(zhì)上的泛素化和乙?；揎?，目前還沒有相關(guān)的報(bào)道。相信隨著該領(lǐng)域的進(jìn)一步深入研究，人們將對(duì)春化作用中PHD-finger蛋白的功能以及植物的開花分子機(jī)理有更深更清晰的認(rèn)識(shí)。

REFERENCES

[1]Schmitz RJ, Amasino RM.Vernalization: a model for investigating epigenetics and eukaryotic gene regulation in plants.Biochim Biophys Acta, 2007, 1769(5/6): 269?275.

[2]Boss PK, Bastow RM, Mylne JS, et al.Multiple pathways in the decision to flower: enabling, promoting, and resetting.Plant Cell, 2004, 16(Suppl): S18?31.

[3]Suárez-López P, Wheatley K, Robson F, et al.CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis.Nature, 2001, 410(6832):1116?1120.

[4]Samach A, Onouchi H, Gold SE, et al.Distinct roles of CONSTANS target genes in reproductive development of Arabidopsis.Science, 2000, 288(5471): 1613?1616.

[5]Sung S, Amasino RM.Vernalization in Arabidopsis thaliana is mediated by the PHD fi nger protein VIN3.Nature, 2004, 427(6970): 159?164.

[6]Li XB, Zhang JW.Structure and function of zinc finger proteins in Eucaryon.Chin J Biochem Mol Biol, 2009,25(3): 206?211.李曉波, 張俊武.真核生物中鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)與功能.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2009, 25(3): 206?211.

[7]Kaadige MR, Ayer DE.The polybasic region that follows the plant homeodomain zinc finger 1 of Pf1 is necessary and sufficient for specific phosphoinositide binding.J Biol Chem, 2006, 281(39): 28831?28836.

[8]Schindler U, Beckmann H, Cashmore AR.HAT3.1, a novel Arabidopsis homeodomain protein containing a conserved cysteine-rich region.Plant J, 1993, 4(1): 137?150.

[9]Sung S, Amasino RM.Molecular genetic studies of the memory of winter.J Exp Bot, 2006, 57(13): 3369?3377.

[10]Townsley FM, Thompson B, Bienz M.Pygopus residues required for its binding to Legless are critical for transcription and development.J Biol Chem, 2004, 279(7):5177?5183.

[11]Bienz M.The PHD finger, a nuclear protein-interaction domain.Trends Biochem Sci, 2006, 31(1): 35?40.

[12]Ma HH, Fang CL, Zeng PY.Plant homeodomain(PHD domain)—the code reading of histone code.Prog Biochem Biophys, 2008, 35(6): 625?630.馬紅輝, 方存磊, 曾平耀.植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD結(jié)構(gòu)域)—組蛋白密碼的解讀器.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008, 35(6): 625?630.

[13]Michaels SD, Amasino RM．FLOWERlNG LOCUS C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering.Plant Cell, 1999, 11(5): 949?956.

[14]Scortecci K, Michaels SD, Amasino RM.Genetic interactions between FLM and other flowering-time genes in Arabidopsis thaliana.Plant Mol Biol, 2003, 52(5):915?922.

[15]Luger K, Richmond TJ.The histone tails of the nucleosome.Curr Opin Genet Dev, 1998, 8(2): 140?146.

[16]Peterson CL, Laniel MA.Histones and histone modifications.Curr Biol, 2004, 14(14): R546?551.

[17]Richards EJ, Elgin SC.Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects.Cell, 2002, 108(4): 489?500.

[18]He Y, Amasino RM.Role of chromatin modification in flowering-time control.Trends Plant Sci, 2005, 10(1):30?35.

[19]Schubeler D, MacAlpine DM, Scalzo D, et al.The histone modification pattern of active genes revealed through genome-wide chromatin analysis of a higher eukaryote.Genes Dev, 2004, 18(11): 1263?1271.

[20]He Y, Dovle MR, Amasino RM.PAF1-complex-mediated histone methylation of FLOWERING LOCUS C chromatin is required for the vernalization responsive, winter-annual habit in Arabidopsis.Genes Dev, 2004, 18(22): 2774?2784.

[21]Santos-Rosa H, Schneider R, Bernstein BE, et al.Methylation of histone H3K4 mediates association of the lsw1p ATPase with chromatin.Mol Cell, 2003, 12(5):1325?1332.

[22]Zhao ZH, Zeng Q, Zhao SQ.The molecular mechanism of vernalization in plants.Chin Bull Bot, 2006, 23(1): 60?67.趙仲華, 曾群, 趙淑清.植物春化作用的分子機(jī)理.植物學(xué)通報(bào), 2006, 23(1): 60?67.

[23]Dennis ES, Peacock WJ.Epigenetic regulation of flowering.Curr Opin Plant Biol, 2007, 10(5): 520?527.

[24]Levy YY, Mesnage S, Mylne JS, et al.Multiple roles of Arabidopsis VRN1 in vernalization and flowering time control.Science, 2002, 297(5579): 243?246.

[25]Gendall AR, Levy YY, Wilson A, et al.The VERNALIZATION 2 gene mediates the epigenetic regulation of vernalization in Arabidopsis.Cell, 2001,107(4): 525?535.

[26]De Lucia F, Crevillen P, Jones AM, et al.A PHD-polycomb repressive complex 2 triggers the epigenetic silencing of FLC during vernalization.Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(44): 16831?16836.

[27]Sung S, Schmitz RJ, Amasino RM.A PHD finger protein involved in both the vernalization and photoperiod pathways in Arabidopsis.Genes Dev, 2006, 20(23):3244?3248.

[28]Greb T, Mylne JS, Crevillen P, et al.The PHD finger protein VRN5 functions in the epigenetic silencing of Arabidopsis FLC.Curr Biol, 2007, 17(1): 73?78.

[29]Finnegan EJ, Dennis ES.Vernalization-induced trimethylation of histone H3 lysine 27 at FLC is not maintained in mitotically quiescent cells.Curr Biol, 2007,17(22): 1978?1983.

[30]Sung S, He Y, Eshoo TW, et al.Epigenetic maintenance of the vernalized state in Arabidopsis thaliana requires LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1.Nat Genet,2006, 38(6): 706?710.

[31]Fu D, Dunbar M, Dubcovsky J.Wheat VIN3-like PHD finger genes are up-regulated by vernalization.Mol Genet Genomics, 2007, 277(3): 301?313.

[32]Park BS, Sang WG, Yeu SY, et al.Post-translational regulation of FLC is mediated by an E3 ubiquitin ligase activity of SINAT5 in Arabidopsis.Plant Sci, 2007,173(2): 269?275.

[33]Robertson M, Helliwell CA, Dennis ES.Post-translational modifications of the endogenous and transgenic FLC protein in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol, 2008,49(12): 1859?1866.

Function of plant homeodomain-finger proteins in vernalization pathway in Arabidopsis and other cruciferous plants

Gongling Hu, Guoping Chen, Zongli Hu, Feng Gu, and Yong Li
Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400030, China

Received:September 3, 2009;Accepted:November 11, 2009

Supported by:National Natural Science Fundation of China(Nos.30771464, 30871709), Chongqing University Postgraduates' Innovative Team Building Project(No.200909B1007).

Corresponding author:Guoping Chen.Tel: +86-23-65112674; Fax: +86-23-65112674; E-mail: chenguoping@cqu.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.30771464, 30871709)，重慶大學(xué)研究生創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(No.200909B1007)資助。