王曉杜，陳培君，沈陽，邱亞峰，鄧緒芳，史子學，彭麗娜，羅金燕，劉超，馬志永

中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

H3N2型豬流感病毒M2蛋白表達分析

王曉杜，陳培君，沈陽，邱亞峰，鄧緒芳，史子學，彭麗娜，羅金燕，劉超，馬志永

中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

流感病毒的M2蛋白在流感病毒復制中起著重要作用，是抗流感病毒的靶標分子。本研究以提取的病毒基因組RNA作為模板，RT-PCR擴增H3N2亞型豬流感病毒M2基因，分別構建了重組原核表達載體和重組真核表達載體，建立了M2蛋白的原核和真核表達系統(tǒng)。通過大腸桿菌表達系統(tǒng)，制備了M2重組蛋白，并免疫大鼠制備了多克隆抗體。Western blotting和間接免疫熒光方法檢測表明所制備的抗體能識別真核表達的M2蛋白和病毒感染細胞后表達M2蛋白，具有良好的特異性。重組M2真核表達載體轉染Vero細胞，表達的重組M2蛋白大小為20 kDa，定位于細胞漿中，與病毒感染細胞中的M2蛋白定位相同。Western blotting檢測表明M2蛋白在病毒感染細胞12 h后才能檢出，晚于NS1、NP和M1，屬于病毒復制的晚期蛋白，可作為病毒復制晚期的指示分子。本研究為弄清M2蛋白在病毒復制過程中的生物學功能奠定了基礎。

H3N2，豬流感病毒，M2蛋白，多克隆抗體

Abstract:M2 protein of influenza A virus is encoded by a spliced mRNA derived from RNA segment 7 and plays an important role in influenza virus replication.It is also a target molecule of anti-virus drugs.We extracted the viral genome RNAs from MDCK cells infected with swine influenza A virus(SIV)H3N2 subtype and amplified the SIV M2 gene by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using the isloated viral genome RNAs as template.The amplified cDNA was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a(+)(designated pET-28a(+)-M2)and a eukaryotic expression vector p3xFLAG-CMV-7.1(designated p3xFLAG-CMV-7.1-M2), respectively.The resulted constructs were confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis.We then transformed the plasmid pET-28a(+)-M2 into Escherichia coli BL21(DE3)strain and expressed it by adding 1 mmol/L of IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside).The recombinant M2 protein was purified from the induced bacterial cells using Ni2+affinity chromatography.Wistar rats were immunized with the purified M2 protein for producing polyclonal antibodies specific for it.Western blotting analysis and immunofluorescence analysis showed that the produced antibodies were capable of reacting with M2 protein expressed in p3xFLAG-CMV-7.1-M2-transfected cells as well as that synthesized in SIV-infected cells.We also transfected plasmid p3xFLAG-CMV-7.1-M2 into Vero cells and analyzed its subcellular localization by immunofluorescence.The M2 protein expressed in the Vero cells was 20 kDa in size and dominantly localized in the cytoplasm, showing a similar distribution to that in SIV-infected cells.Western blotting analysis of SIV-infected cells suggested that M2 was a late phase protein,which was detectable 12 h post-infection, later than NS1, NP and M1 proteins.It would be a potential molecular indicator of late phases replication of virus.Our results would be useful for studying the biological function of M2 protein in SIV replication.

Keywords:swine influenza virus, H3N2 subtype, M2 protein, gene expression

近年來流感病毒給人類帶來巨大災難，特別是高致病性禽流感不僅給雞群帶來毀滅性打擊，也給人類帶來了生命的威脅。而豬作為人、禽流感的混合器，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生方面具有重要的研究意義，豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來重要影響，也可能給人類帶來威脅，最近爆發(fā)于墨西哥的甲型 H1N1病毒就是來源于豬流感病毒形成的三元重配病毒，給人類帶來了巨大災難[1]，因此，研究豬流感病毒的發(fā)病機理就顯得尤為重要，同時也可為人流感的防控提供一些依據。

流感病毒是由 8個基因組 RNA組成的負鏈病毒，目前已知編碼11種蛋白。M2蛋白單體由流感病毒基因組片段7編碼的97個氨基酸組成，包含3個結構域：暴露在外面的N端24個氨基酸，跨膜區(qū)的19個疏水氨基酸和C端朝向病毒內部的54個氨基酸。流感病毒的 M2蛋白是一種整合在病毒殼膜上的離子通道蛋白，它們形成同源四聚體的離子通道，每個單元之間是通過二硫鍵相連，離子通道能被低的pH值所激活。在流感病毒復制中，病毒HA蛋白與受體結合，隨著細胞的內吞作用，在胞內形成內噬體，暴露在低pH下的M2蛋白形成離子通道，H+進入病毒粒子內，HA蛋白構型發(fā)生轉換并且與膜發(fā)生融合，打開病毒粒子的殼膜，低 pH值減弱M1和RNP蛋白之間的相互作用，釋放RNP進入細胞核[2-4]，所以M2蛋白在病毒入侵中起到關鍵作用。金剛烷胺抗流感病毒藥物就是利用此功能，抑制離子通道的產生，從而抑制流感病毒的復制。最近研究報道了M2蛋白跨膜區(qū)的2個不同結構的高清晰圖片，揭示了抗流感病毒藥物金剛烷胺的綁定位點[5-6]。金剛烷胺既能影響所有A型流感病毒的脫殼[7-8]，也能在另外一些亞型流感病毒復制的晚期，通過阻止病毒的包裝和出芽抑制其復制[9]。流感病毒 M2作為抗病毒藥物靶標，盡管金剛烷胺的作用機制已經清楚，但是在臨床中具有較強的副作用，因此研究以M2蛋白為靶標分子的新型抗病毒藥物，為防治流感的大爆發(fā)做好準備工作是至關重要的。

流感病毒M2蛋白在病毒復制中具有重要作用，又是抗病毒研究的重要靶標分子，本研究利用分子生物學方法，克隆了 H3N2亞型豬流感病毒的 M2基因，分別構建了重組原核表達載體和重組真核表達載體，制備了其特異性抗體，分析了 M2的表達特性，為M2蛋白的相關研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豬流感病毒(A/Swine/Jiangsu/2/2006(H3N2))、大腸桿菌DH5α和BL21、Vero細胞、MDCK細胞、原核表達質粒 pET-28a(+)、真核表達質粒p3xFLAG-CMV-7.1由本室保存。Wistar大鼠購于中國科學院上海實驗動物中心。

AMV反轉錄酶、PCR擴增用Taq酶、各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、T載體試劑盒購自寶生物公司；質粒抽提和DNA片段回收試劑盒購自博大泰克生物技術公司；His band凝膠純化柱購于Novagen公司；弗氏佐劑購于 Sigma公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購于Invitrogen公司；DMEM和胎牛血清購于Gibco公司；HRP標記的羊抗小鼠IgG、HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗大鼠 IgG、TFITC標記的羊抗小鼠 IgG、FITC標記的羊抗大鼠IgG購自Santa Cruz公司；ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與原核表達

流感病毒感染MDCK細胞12 h后，提取細胞總RNA，利用olig(d)T作為反轉錄引物，AMV酶反轉錄合成cDNA，M2基因編碼區(qū)引物：上游5'-TATGAA TTCATGAGCCTTCTAACCG-3'; 下游5'-CGCGTCG ACTTACTCCAGCTCTATGTT-3', RT-PCR擴增獲得一個約300 bp的產物。EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切亞克隆到pET-28a(+)載體上，構建pET-28a(+)-M2重組表達載體。

pET-28(a)-M2重組表達載體轉化進大腸桿菌BL21(DE3)后，1 mmol/L IPTG 誘導 3 h，15%SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，篩選陽性克隆。

1.2.2 原核表達產物的純化與免疫

上述鑒定好的克隆菌株，擴大培養(yǎng)。參照Marshak等[10]的方法提取包涵體，利用His-Band Ni+柱進行親和層析純化，SDS-PAGE檢測純化效果，純化后M2蛋白免疫Wistar大鼠(100 μg/只)，第一次采用弗氏完全佐劑(1:1)，后面免疫采用弗氏不完全佐劑每2周免疫1次，連續(xù)免疫5次。乙醚麻醉后心臟采血，收集血清。

1.2.3 真核表達載體的構建和重組蛋白真核表達

利用上游引物 5'-TATGAATTCGATGAGCCTT CTAACCG-3'和下游引物 5'-CGCGTCGACTTACT CCAGCTCTATGTT-3'，以質粒 pET-28a(+)-M2為模板 PCR擴增，亞克隆該片段到真核表達質粒p3xFLAG-CMV-7.1上，EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。陽性克隆擴大培養(yǎng)，利用大提試劑盒，提取高純度的重組質粒p3xFLAG-CMV-7.1-M2。

根據試劑盒說明書上的方法，利用脂質體Lipofectamine 2000，轉染重組質粒p3xFLAG-CMV-7.1-M2到單層Vero細胞中，轉染24 h收取細胞樣品，BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。

收集樣品進行15%凝膠SDS-PAGE電泳，轉印到硝酸纖維素膜上，室溫封閉 2 h后，適當比例稀釋的一抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗5次，添加ECL發(fā)光試劑盒底物，暗室曝光膠片顯色。

1.2.4 M2多克隆抗體的效價和特異性檢測

采用間接ELISA方法檢測其效價，利用原核表達產物包被ELISA板，將收集到的血清按不同稀釋度加入孔內，37℃作用1 h，PBST漂洗3次，加入HRP標記的二抗37℃作用1 h，漂洗5次后，加入TMB底物避光顯色30 min，然后在酶標儀上450 nm測定OD值。

5個MOI(Multiple of infection，多重感染復數(shù))的H3N2豬流感病毒接種Vero細胞，37℃孵育1 h，棄上清，更換含有TPCK胰酶的DMEM維持液，不同時間點收集細胞樣品，裂解細胞樣品后，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后利用上述方法，Western blotting檢測病毒表達的M2蛋白和其他病毒蛋白。

Vero細胞生長在蓋玻片上，按照上述方法轉染真核表達質粒和接種病毒，24 h后，去除上清，PBS洗滌3次，加入固定液(4%甲醛：10%甲醇)固定20 min，PBS洗滌 3次，37℃下用 1% NP40處理30 min，PBS洗滌3次，10%羊血清37℃封閉30 min，PBS洗滌3次，適當比例的一抗37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，熒光標記的二抗37℃孵育30 min，TBS洗滌3次，DAPI室溫染色10 min，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察蛋白的亞細胞定位。

2 結果與分析

2.1 M2基因的克隆和原核、真核表達載體的構建

SIV的M2基因是流感病毒片段 7的剪切體，RT-PCR擴增出大約300 bp的片段(圖1a)，經DNA序列分析，所克隆的 M2基因的開放閱讀框架為294 bp，編碼97個氨基酸，與A/swine/Shandong/nc/2005(H9N2)和 A/chicken/Jiangsu/wa/2002(H9N2)同源性分別高達 100%和 97%。將該片段純化回收后，亞克隆到 pET-28a(+)載體上，構建 pET-28a(+)-SIV-M2重組原核表達載體，PCR、酶切和測序鑒定獲得陽性克隆(圖1b)。將該片段亞克隆到真核表達載體p3xFLAG-CMV-7.1上，獲得p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2重組真核表達載體，酶切鑒定和測序鑒定獲得陽性克隆(圖1c)。

2.2 原核表達及純化

重組表達質粒pET-28 a(+)-M2轉化進大腸桿菌BL21(DE3)中，1 mmol/L IPTG誘導 3 h后收樣，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，結果顯示 M2蛋白得到較好表達，分子量大小為20 kDa左右。該陽性克隆菌株經大量培養(yǎng)，誘導表達，超聲破碎后，得到包涵體沉淀，然后利用Novegen公司的His-band親和層析柱純化所得重組蛋白，純化后經SDS-PAGE分析，顯示 M2蛋白純化效果較好(圖2)，獲得了比較純的抗原以進一步制備抗體。

圖1 SIV的M2基因克隆和原核、真核表達重組質粒的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of swine influenza virus M2 gene and restricted enzymes digestion of pET-28a(+)-M2 and p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2 plasmid.(a)PCR amplification of swine influenza virus M2 gene.M: DL2000 marker; 1: M2 PCR production.(b)Restricted enzymes digestion of pET-28a(+)-M2 plasmid.M: DL2000, 1 kb marker; 1: enzymes digestion of pET-28a(+)-M2; 2: enzymes digestion of pET-28a(+).(c)Restricted enzymes digestion of p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2 plasmid.M: 1 kb, DL2000 marker; 1: enzymes digestion of p3xFLAG-CMV-7.1-SIV-M2; 2: PCR production of swine influenza virus M2 gene.

圖2 SDS-PAGE檢測pET-28a(+)-M2的表達及純化Fig.2 SDS-PAGE of inclusion bodies(pET-28a(+)-M2)and purification.M: protein marker; 1: lysate of BL21(pET-28a(+))inducing by IPTG; 2: lysate of BL21 without inducing; 3: lysate of BL21(pET-28a(+)-M2)inducing by IPTG; 4: cracked supernatant BL21(pET-28a(+)-M2); 5?7: purification of inclusion bodies pET-28a(+)-M2.

2.3 抗M2抗體制備和特異性分析

2.3.1 抗M2抗體ELISA效價檢測

高純度的重組M2蛋白免疫Wistar大鼠，重復5次免疫后麻醉心臟采血，制備抗M2蛋白的抗血清。以原核表達的重組蛋白按適當濃度(10?50 μg/mL)包被酶標板，間接ELISA方法檢測所制備血清效價，結果顯示ELISA效價為1∶12 800，該抗體具有較高的效價。

2.3.2 Western blotting檢測真核表達及抗體特異性

M2基因亞克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表達載體中，轉染試劑Lipofectamine 2000按說明書上的方法，轉染 2 μg重組質粒 p3xFLAG-CMV-7.1-M2至 Vero細胞，同時轉染 p3xFLAG-CMV-7.1和p3xFLAG-CMV-7.1-M1[11]作為對照，收集轉染細胞樣品，進行Western blotting檢測，一抗先用M2抗體(1：1000)顯色，顯色完成后進行剝離，去掉一抗，然后加入抗FLAG標簽的抗體，ECL發(fā)光試劑盒顯色，顯色結果見圖3。所制備的抗體能識別M2蛋白，但不識別M1，表明具有良好的特異性。為了進一步驗證這一結果，使用流感病毒感染細胞樣品檢驗了所制備抗體的特異性，如圖4所示，流感病毒感染細胞樣品檢測到 M2蛋白，而對照沒有，表明所制備抗體的特異性良好，可用于M2蛋白的研究。

2.4 病毒感染Vero細胞M2蛋白表達

5個MOI流感病毒感染Vero細胞，不同時間點進行取樣，同時設定未感染對照，收集細胞樣品，Western blotting分析M2蛋白表達的時空變化，并與病毒的 NS1、NP、M1蛋白進行了比較。如圖4所示，M2蛋白在感染12 h才可被檢測到，其出現(xiàn)的時間點晚于病毒的 NS1、NP、M1蛋白，可以作為病毒復制的中后期標志蛋白。

2.5 間接免疫熒光檢測M2蛋白亞細胞定位

圖3 重組流感病毒M2蛋白真核表達及其抗體特異性Fig.3 Eukaryotic expression of p3xFLAG-CMV-7.1-M2 and M2 antibody specificity.1: blank control; 2: negative control(p3xFLAG-CMV-7.1); 3: FLAG-M1 protein; 4: FLAG-M2 protein.

Vero細胞轉染p3xFLAG-CMV-7.1-M2真核表達質粒24 h后，間接免疫熒光檢測M2蛋白亞細胞定位。同時使用豬流感病毒感染24 h的Vero細胞為對照，比較分析了M2蛋白的亞細胞定位。如圖5所示，真核表達的 M2蛋白主要定位于細胞漿中，病毒感染細胞中的 M2蛋白也主要在胞漿中表達，與真核轉染的M2蛋白表達一致。

3 討論

圖4 病毒感染Vero細胞中不同蛋白時空表達情況以及M2抗體特異性Fig.4 Western blotting analysis the kinetics of viral protein expression of Vero cell infected with SIV and M2 antibody specificity.Mock is negative control, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 h were various times post-infection, expression analysis of SIV M2,NS1, NP, M1, β-actin were used as a protein loading control.

圖5 免疫熒光對大鼠抗M2抗體特異性檢測和流感病毒M2蛋白亞細胞定位Fig.5 Specificity analysis of M2 antibody and subcellular localization of SIV M2 protein.FLAG-M2were stained with mouse anti-FLAG antibody(red).M2 protein of SIV infection were stained with rat anti-M2 antibody(green).The nucleus were stained with DAPI(blue).Merge is combined with two images.

本研究克隆了豬流感(A/Swine/jiangsu/2/2006(H3N2))M2基因的全長編碼區(qū)，序列長度為294 bp，與 NCBI上的序列比對分析表明，其與H9N2亞型序列同源性高達 100%(A/swine/Shandong/nc/2005(H9N2))和 97%(A/chicken/Jiangsu/wa/2002(H9N2))。這是由于流感病毒的遺傳重組特性決定，進化分析表明[11]，該毒株與H9N2親緣關系較近，并且該病毒的M2和H9N2比較發(fā)現(xiàn)僅在83位和88位氨基酸由A變成V，這些突變沒有改變氨基酸的性質，推測該病毒在重配過程中M基因可能來源于H9N2毒株。

M2蛋白在流感病毒復制中發(fā)揮重要作用，本研究構建豬H3N2亞型流感病毒的M2重組原核表達和真核表達質粒，建立了兩種表達系統(tǒng)。利用原核表達系統(tǒng)制備較純的抗原，該方法制備的抗原具有便宜方便的特點。有研究表明 M2蛋白膜外區(qū)具有高度保守性，可以作為疫苗選擇的對象[12]。所以原核表達系統(tǒng)可以作為豬流感疫苗生產的一條途徑。本研究建立的真核表達系統(tǒng)，既能研究M2蛋白的亞細胞定位，也能為研究該蛋白的功能打下基礎。

本研究以原核表達產物免疫Wistar大鼠制備抗M2抗體，具有較高的效價。特異性研究表明，該抗體既能識別真核表達的 M2蛋白，同時也能識別病毒天然表達的蛋白，為研究 M2蛋白在病毒復制、病毒與細胞相互作用中所扮演的角色提供了較好的工具。在病毒感染細胞不同時間點取樣，Western blotting檢測分析表明，M2蛋白在病毒感染大約12 h后表達量開始急劇上升，與病毒在此時間點復制速度增加密切相關[13]，NS1蛋白最早出現(xiàn)，標志著復制的開始，由于 M2蛋白出現(xiàn)時間稍微晚于其他早期蛋白，因此該蛋白可以作為病毒復制晚期的標志。間接免疫熒光結果表明，不管是在真核轉染細胞中，還是在病毒感染細胞中，M2蛋白的亞細胞定位都是在胞漿中，這與其離子通道蛋白的功能密切相關[14]。

2009年3月以來，爆發(fā)在墨西哥的豬流感，引起100多人死亡，并迅速傳播到全世界很多國家，給人類帶來巨大的災難。本研究中的M2蛋白與新的甲型 H1N1氨基酸序列分析表明，它們之間存在 13、14、16、28、31、43、77、84、88位氨基酸差異，主要分布于M2蛋白的膜外區(qū)和膜內區(qū)，跨膜區(qū)高度保守，新型流感病毒毒力變化是否與此有關需要進一步研究。為了預防和控制流感的大爆發(fā)，研究控制流感病的疫苗和藥物已迫在眉睫，本研究為以 M2為靶標的抗流感藥物研究提供了基礎材料。

REFERENCES

[1]Wang TT, Peter P.Unraveling the mystery of swine influenza virus.Cell, 2009, 137: 983?985.

[2]Bui M, Whittaker G, Helenius A.The effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus vRNPs.J Virol, 1996, 70: 8391?8401.

[3]Zhirnov OP.Isolation of matrix protein M1 from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent.Virology, 1992, 186: 324?330.

[4]Lamb RA, Krug RM.In Fields Virology.4th ed.Philadelphia:Lippincott Williams Wilkins, 2001: 1487?1531.

[5]Stouffer AL, Acharya R, Salom D, et al.Structural basis for the function and inhibition of an influenza virus proton channel.Nature, 2008, 451(7178): 596?599.

[6]Schnell JR, Chou JJ.Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.Nature, 2008,451(7178): 591?595.

[7]Lamb RA, Zebedee SL, Richardson CD.Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface.Cell, 1985, 40(3): 627?633.

[8]Treanor JJ, Tierney EL, Zebedee SL, et al.Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice.J Virol, 1990, 64(3):1375?1377.

[9]Ciampor F, Bayley PM, Nermut MV, et al.Evidence that the amantadine-induced, M2-mediated conversion of influenza A virus hemagglutinin to the low pH conformation occurs in an acidic trans Golgi compartment.Virology, 1992, 188: 14?24.

[10]Marshak DR, Kadonaga JT, Burgess RR, et al.Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual.New York: Cold spring Harbor Laboratory Press, 1996: 148?156.

[11]Guo L, Wang XD, Ma ZY, et al.Cloning and characterization of M1 gene of H3N2 subtype swine influenza virus.Chin J Biotech, 2009, 25(5): 672?678.郭林, 王曉杜, 馬志永, 等.H3N2亞型豬流感病毒 M1基因克隆及表達特性分析.生物工程學報, 2009, 25(5):672?678.

[12]Ilyinskii PO, Gambaryan AS, Meriin AB.Inhibition of influenza M2-induced cell death alleviates its negative contribution to vaccination efficiency.PLoS ONE, 2008,1(e1417): 1?4.

[13]Shen Y, Wang XD, Ma ZY, et al.Influenza A virus induces p53 accumulation in a biphasic pattern.Biochem Biophys Res Commun, 2009, 382(2): 331?335.

[14]Sugrue RJ, Hay AJ.Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channel.Virology, 1991, 180: 617?624.

Characterization of M2 gene of H3N2 subtype swine influenza virus

Xiaodu Wang, Peijun Chen, Yang Shen, Yafeng Qiu, Xufang Deng, Zixue Shi, Lina Peng,Jinyan Luo, Chao Liu, and Zhiyong Ma
Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Shanghai 200241, China

Received:September 4, 2009;Accepted:November 11, 2009

Supported by:Shanghai Pujiang Program(No.07pj14109), Key Project of Basic Research for National Non-profit Fund of China(No.2007JB0264).

Corresponding author:Zhiyong Ma.Tel: +86-21-34293139; E-mail: zhiyongma@shvri.ac.cn上海市浦江人才計劃(No.07pj14109)，中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金重點項目(No.2007JB0264)資助。