劉平果，李國強，陳毅歆，羅海峰，黃德黨，王穎彬，葛勝祥，張軍，夏寧邵

1 廈門大學附屬中山醫(yī)院 肝膽外科，廈門 361004 2 廈門大學生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361005

一種定量檢測人血清高敏C反應蛋白的化學發(fā)光免疫方法

劉平果1*，李國強2*，陳毅歆2，羅海峰2，黃德黨2，王穎彬2，葛勝祥2，張軍2，夏寧邵2

1 廈門大學附屬中山醫(yī)院 肝膽外科，廈門 361004 2 廈門大學生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361005

旨在建立一種可定量檢測人血清高敏CRP的化學發(fā)光檢測方法(High-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay，hs-CRP CLIA)。首先利用親和層析和離子交換層析技術從肝硬化病人腹水中純化出高純度的天然CRP作為免疫原制備了22株CRP單克隆抗體(單抗)，其中13株單抗在磷酸膽堿配體捕獲ELISA中呈陽性，然后利用方正滴定法篩選出單抗10C5和10C11建立了hs-CRP CLIA。試劑盒評估結果顯示：該方法對血清中干擾物質IgG、血紅蛋白、甘油三酯等無非特異性反應；該方法檢測靈敏度高，在0.04～20.38 mg/L范圍內定量檢測人血清CRP標準品呈良好線性關系(R2＞0.993)；該方法準確性高、可重復性好，平均回收率為99%，批內差為4.2%～5.8%，批間差為9.0%～11.5%；該方法與進口商品化高敏CRP ELISA試劑盒平行比較檢測90份血清標本，結果顯示兩者有良好的可比性(r=0.968)。綜上，建立的hs-CRP CLIA是一種準確、可靠、可定量的高靈敏C反應蛋白檢測方法，該方法的臨床應用，有利于改善我國心臟病風險評估及腸炎性疾病預后判斷。

高敏，C反應蛋白，單克隆抗體，化學發(fā)光，心血管疾病，腸炎性疾病

Abstract:We developed a high-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay(hs-CRP CLIA).The high-purity native CRP was purified from hepatic cirrhosis patient ascetic fluid by affinity and ion exchange chromatography and used as an immunogen to develop the monoclonal antibodies(mAbs)against CRP.Twenty-two mAbs were identified reactive with CRP in ELISA and 13 of them were reactive in the phosphorycholine ligand capture ELISA.The mAbs 10C5 and 10C11 were selected to develop the hs-CRP CLIA.The linearity and performance of the hs-CRP CLIA was characterized.It was showed notreactive when testing against other serum materials(IgG, hemoglobin and triglyceride).The reliable correlation(R2＞ 0.993)was obtained between testing value(RLU/S)and the concentration of human serum CRP calibrator.The linearity fell in the range of 0.04?20.38 mg/L.The assay has good accuracy and reproducibility, the mean recovery was 99% and the precision of the intra- and inter assay was CVs(4.2%?5.8%)and(9.0%?11.5%), respectively.In testing of 90 human sera, this assay performed well and correlated comparably with a commercial hs-CRP ELISA kit.Thus, hs-CRP CLIA is an accurate, reliable, quantifiable assay for detection of high-sensitive C-reactive protein in serum, it may be useful to improve the risk assessment of cardiovascular disease and the prognosis of inflammatory bowel disease.

Keywords:high-sensitivity, C-reactive protein, monoclonal antibody, chemiluminescent, cardiovascular disease, inflammatory bowel disease

C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種能與肺炎球菌C多糖發(fā)生沉淀反應的血漿急性時相蛋白[1]。正常人體血漿中CRP濃度一般低于10 mg/L，在機體出現疾病炎癥或組織損傷的 6～8 h后血漿中CRP濃度迅速升高上百倍，在炎癥消除后血漿CRP以4～9 h半衰期快速減少至10 mg/L以下，即體內CRP水平升高幅度與炎癥感染程度呈正相關，因此CRP在臨床上常被用作炎癥檢測指標[2]。在研究發(fā)現炎癥是冠狀動脈粥樣硬化形成的重要因素后[3-4]，CRP作為一種優(yōu)秀的炎癥標志物引起了許多心血管疾病專家的興趣[5]。目前國內外已有大量臨床流行病學研究結果證實CRP是一個理想的心血管疾病發(fā)病風險預測指標，人血漿中CRP在0～10 mg/L范圍內的濃度高低與未來發(fā)生心血管疾病的風險高低有關[6-13]。因此，CRP還是一個評估心臟病發(fā)生率、復發(fā)率、死亡率的臨床重要指標。

臨床上使用的CRP診斷試劑大致分成2大類[14]：第一類是普通CRP診斷試劑，其檢測靈敏度較低，檢測下限不低于 3 mg/L，用作鑒別 CRP濃度介于10～40 mg/L間的慢性炎癥和介于40～200 mg/L間的急性炎癥。第二類是高敏 CRP診斷試劑(High-sensitivity CRP，hs-CRP)，其檢測靈敏度高，檢測下限可低于0.3 mg/L，能準確定量0.1～10 mg/L濃度范圍內的 CRP，使臨床上根據血漿 CRP在0～10 mg/L范圍內的濃度高低評估心臟病發(fā)病風險的方式得以實現。國外已有基于多種不同方法學的商品化hs-CRP診斷試劑盒，包括乳膠增強比濁法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法、化學發(fā)光法等[15]。其中Dade Behring公司的乳膠增強比濁法產品是第一個被美國FDA批準的專門用于心血管疾病風險評估的國際標準hs-CRP試劑盒，由于該產品需要配備大型生化分析儀、且價格較高，因而限制了自身的推廣應用[16]。免疫層析法產品雖然具有操作方便的優(yōu)點，但其分析靈敏度、定量分析性能等問題仍有待完善?；瘜W發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法是新的hs-CRP測定方法，具有更高的靈敏度、準確度、重復性及成本低等優(yōu)勢，其中化學發(fā)光法的定量分析能力比ELISA更好，技術也較成熟，容易被臨床單位接受，具有較好的應用前景。目前我國臨床心臟病風險預測尚較少使用hs-CRP檢測指標，除了我國此方面研究起步比國外晚之外，最主要原因是hs-CRP試劑盒主要依賴進口，價格昂貴不利于大規(guī)模推廣使用，雖然近年來國內診斷公司也有新開發(fā)的 hs-CRP試劑盒，但其關鍵單抗原料也多依賴進口[17-18]。因此，本研究目的是建立天然CRP及其特異性單抗的原料制備方法，然后以識別天然CRP的單抗為原料，基于化學發(fā)光檢測技術建立一種國產 hs-CRP化學發(fā)光定量檢測試劑盒(hs-CRP CLIA)。

1 材料與方法

1.1 材料

用作實驗對照和特異性分析的材料包括：人血清CRP標準品(Human serum CRP calibrator，Dako Cytomation)、兔抗 CRP多抗(Dako Cytomation)、商品化CRP純化蛋白(Calbiochem)、人IgG(南京奧多福尼生物科技有限公司)、血紅蛋白標準品(上海楷洋生物技術有限公司)、甘油三酯(上海匯普工業(yè)化學品有限公司)。富含天然CRP蛋白的肝硬化病人腹水來自廈門大學附屬中山醫(yī)院；人血清標本來自廈門市中心血站。

1.2 CRP蛋白的純化及鑒定

首先使用高速離心方法(23 000×g，30 min)除去人腹水中的雜質；然后用磷酸膽堿親和介質(Immobilized p-Amino phenyl Phosphoryl Chloline Gel，PC-Gel，Pierce)按操作說明書提供的方法從腹水中提取出粗純的CRP蛋白；然后用SDS-PAGE鑒定出含有目標產物的洗脫峰樣品，繼續(xù)在 HPLC上用陰離子交換層析柱(Super Q 5PW 7.5×7.5，TOSOH)純化，用含有 0.15～1 mmol/L NaCl的Tris-HCl溶液進行梯度洗脫，最終得到高純度的CRP蛋白透析到含有2 mmol/L CaCl2的Tris-HCl緩沖液中長期保藏于?70℃冰箱。CRP蛋白純度使用SDS-PAGE鑒定，CRP特異性使用CRP兔多抗進行Western blotting鑒定，CRP分子量大小使用G5000分子篩層析柱(G5000 PW 7.8×30，TOSOH)鑒定。

1.3 CRP單克隆抗體的制備

按常規(guī)雜交瘤制備方法[19]，選用6周齡的雌性Balb/C小鼠(北京維通利華公司)，經皮下注射免疫天然CRP蛋白，免疫劑量為100 μg/只，初免用等量福氏完全佐劑，免疫加強用等量不完全福氏佐劑，加強免疫4次，免疫間隔2周，融合前3天靜脈注射 100 μg天然 CRP蛋白。收集免疫小鼠的脾臟 B細胞與小鼠骨髓瘤細胞株(Sp2/0-Ag14，Sp2/0)用PEG 1500進行細胞融合，形成的雜交瘤細胞經過ELISA檢測、克隆化操作、腹水誘導和純化獲得純化CRP單抗。單抗采用改良過碘酸鈉法[19]標記辣根過氧化酶(HRP)。

1.4 間接ELISA

使用間接ELISA篩選CRP單抗。使用含2 mmol/L CaCl2的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)稀釋天然CRP蛋白，按100 ng/孔包被在96孔微孔板上，37℃孵育2 h；然后使用含2%明膠的PB緩沖液在37℃下封閉2 h，甩干封閉液，真空密封保存?zhèn)溆?。檢測時每孔加入 50 μL單抗雜交瘤細胞上清，37℃孵育30 min，用1×PBST(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)洗板5次，加入標記HRP的羊抗鼠二抗100 μL，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入顯色液，10 min后在微孔酶標儀(TECAN)讀值。

1.5 配體捕獲ELISA

將天然CRP特異性配體偶聯(lián)蛋白(如PC-BSA)預包被于聚乙烯微孔板上，再通過配體將五聚體CRP結合于微孔板上，避免直接包被導致天然CRP抗原性發(fā)生改變，該方法可鑒定 CRP單抗對天然CRP的捕獲能力[20]。在96孔微孔板上包被800 ng/孔的 PC-BSA(Bioresearch Technologies)，37℃孵育2 h，然后使用含2%明膠的PB緩沖液在37℃下封閉2 h，甩干封閉液，真空密封保存?zhèn)溆?。檢測時加入20 ng/孔天然CRP蛋白，37℃孵育30 min，再加入50 μL 分泌CRP單抗的雜交瘤細胞上清，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入預稀釋的羊抗鼠HRP標記二抗100 μL，37℃孵育30 min，PBST洗板 5次，加入顯色液，10 min后在微孔酶標儀(TECAN)讀值。

1.6 CRP化學發(fā)光免疫檢測方法的建立

將純化后的CRP捕獲單抗用20 mmol/L的磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)溶解，按每孔100 ng包被于聚乙烯微孔板上，37℃孵育2 h，放置4℃過夜，PBST洗液洗板1次，37℃封閉2 h。甩干封閉液，真空密封保存?zhèn)溆?。檢測時加入100 μL 樣品，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入100 μL CRP酶標單抗，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入化學發(fā)光顯示底物(Pierce)，在Orion II微孔板式化學發(fā)光檢測儀(Berthold)上讀取RLU/S值。

1.7 hs-CRP CLIA的實驗室評估

利用本研究建立的hs-CRP CLIA檢測不同濃度的 IgG、血紅蛋白標準品、甘油三酯等血清中常見干擾物質以判定該方法的檢測特異性；檢測不同濃度范圍的人血清CRP標準品，采用回歸分析確定該方法的線性檢測范圍；通過回收率實驗和精密度實驗判定該方法的準確性和可重復性。

1.8 hs-CRP CLIA與同類試劑盒的比較

美國BIOCHECK公司生產的hs-CRP ELISA試劑盒是一種已通過美國FDA和中國SFDA認證的高敏C反應蛋白商品化試劑盒，選擇該對照試劑盒與本研究建立的hs-CRP CLIA平行檢測90份人血清標本，使用微孔酶標儀(TECAN公司)讀值，檢測結果作線性回歸分析。

2 結果

2.1 天然CRP蛋白的制備

病人腹水經親和層析和離子交換層析兩步純化得到天然CRP，再經SDS-PAGE鑒定純度。如圖1A所示，泳道1為經PC-Gel親和介質一步純化得到的粗純CRP，泳道2為再次經Super Q離子交換層析得到的電泳單一純的純度約 95%的 CRP蛋白，泳道3為商品化CRP純化蛋白對照，其分子量約23 kDa，與本研究純化CRP的分子量大小一致；圖1B顯示在Western blotting中，所純化的CRP與商品化CRP兔多抗有特異反應性。進一步在HPLC上用G5000分子篩層析鑒定純化后CRP的分子量，結果(圖2)顯示樣品主峰出現在約 20 min處，與商品化天然五聚體CRP的出峰位置一致。上述結果表明本研究純化的 CRP是天然五聚體 CRP，為后續(xù)CRP單抗制備提供關鍵原料。

圖1 純化CRP的SDS-PAGE和Western blotting鑒定圖Fig.1 SDS-PAGE and Western blotting analysis of CRP purified from human ascetic fluid.(A)SDS-PAGE analysis.M:protein marker; 1: crude CRP sample eluted by PC-Gel affinity chromatography; 2: high-purity CRP sample eluted by Super Q ion exchange chromatography; 3: commercial native CRP control.(B)Western blotting analysis of high-purity CRP.

圖2 純化CRP的分子篩分析圖Fig.2 Molecular exclusion chromatography analysis of the purified CRP protein.

2.2 CRP單抗的制備及鑒定

以純化天然CRP為免疫原，采用小鼠雜交瘤融合技術和間接ELISA方法篩選出22株能穩(wěn)定分泌CRP抗體的雜交瘤細胞。配體捕獲ELISA分析顯示，22株 CRP單抗中有 13株單抗反應陽性，分別是1B10、5D4、7F3、7D9、9D5、10C5、10C11、10F7、12D8、13H9、14H6、15D6、16G2，表明這13株單抗能夠結合天然 CRP，其識別表位可能位于五聚體蛋白表面，另外有9株CRP單抗(3D11、4F4、8A3、8D4、12A2、13H4、16C3、16H3、19H3)反應均為陰性，表明這9株單抗不能結合天然CRP，其識別表位可能隱藏于 CRP五聚體內部。進一步用條帶Western blotting分析，結果(未給出)顯示，22株單抗中只有10C11、8D4和16H3等3株單抗反應呈陽性，提示這3株單抗識別CRP蛋白中偏線性表位，其中捕獲ELISA陽性單抗10C11在Western blotting中呈強陽性，而捕獲ELISA陰性單抗8D4和16H3在Western blotting中呈弱反應，提示單抗10C11可能識別CRP中優(yōu)勢表位。

2.3 高敏CRP化學發(fā)光檢測方法(hs-CRP CLIA)的建立

制備上述13株能捕獲天然CRP的單抗腹水，經硫酸銨沉淀和DE-52層析純化得到高純度CRP單抗，使用過碘酸氧化法標記辣根過氧化酶(HRP)，基于化學發(fā)光檢測技術，建立檢測CRP的雙抗體夾心 CLIA方法，采用方正滴定法篩選配對單抗，以靈敏度高、本底低、線性范圍廣為選擇標準，最終確定 10C5為包被單抗，10C11為酶標單抗，建立hs-CRP CLIA。

用hs-CRP CLIA檢測人IgG(5 g/L、10 g/L、25 g/L)、血紅蛋白(12 g/L、24 g/L、36 g/L)和甘油三酯(2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L)等3種血清中常見干擾物質。結果顯示hs-CRP CLIA對人IgG、血紅蛋白、甘油三酯等3種物質的檢測P/N值均小于2.1，表明hs-CRP CLIA有較好的特異性。

將人血清CRP標準品從163 mg/L按2倍倍比連續(xù)稀釋至0.04 mg/L，然后用hs-CRP CLIA測定稀釋后標準品的發(fā)光值，經回歸分析繪制CRP檢測標準曲線，結果(圖3)顯示，hs-CRP CLIA對濃度介于 0.04～20.38 mg/L之間 CRP有較好的檢測線性(R2=0.9938)。

圖3 hs-CRP CLIA檢測人血清CRP標準品的標準曲線Fig.3 Calibration curve obtained for the hs-CRP CLIA with a linear dynamic range between 0 and 20.38 mg/L of human serum CRP calibrator.

2.4 hs-CRP CLIA的可重復性

本研究使用精密度實驗和回收率實驗確定hs-CRP CLIA的檢測準確性和可重復性。精密度實驗中，將人血清CRP標準品稀釋成低、中、高3個濃度樣品，在同一天內每隔1 h用hs-CRP CLIA測定一次，共測10次，得出hs-CRP CLIA的批內變異系數(CV，%)為4.2%～5.8%，小于標準值10%；取相同樣品分成10份凍存，每天測定1次，連續(xù)測定 10 d，得出批間變異系數(CV，%)為 9.0%～11.5%，小于標準值15%(表1)，說明hs-CRP CLIA精密度良好?；厥章蕦嶒炛?，取人血清CRP標準品稀釋成介于0～10 mg/L范圍內的不同濃度樣品，每份樣品重復檢測3次，取平均值后，計算回收率(回收率=檢測值/實際值×100%)。結果表 2顯示，hs-CRP CLIA檢測不同濃度CRP標準品的回收率介于 95%～102%之間，平均回收率為 99%，表明hs-CRP CLIA具有較好的檢測準確性。

表1 hs-CRP CLIA的精密度分析Table 1 Precision of the hs-CRP CLIA

表2 hs-CRP CLIA的回收率分析Table 2 Recovery of the hs-CRP CLIA

2.5 hs-CRP CLIA與同類試劑盒的比較

用美國BIOCHECK公司生產的hs-CRP ELISA試劑盒與hs-CRP CLIA平行檢測90份血清樣品，檢測結果經線性回歸分析(r=0.968，P＞0.05)，顯示兩者檢測結果無顯著性差異，具有很好的可比性(圖4)。

圖4 比較hs-CRP CLIA與BIOCHECK hs-CRP ELISA的檢測相關性Fig.4 Comparison between the hs-CRP CLIA and the BIOCHECK hs-CRP ELISA.

3 討論

本研究的主要目的之一是制備識別天然CRP的單抗原料，為此需要首先獲得抗原性正確的CRP蛋白作為免疫原。血清中天然CRP是由5個完全相同的分子量約23 kDa的單體CRP蛋白以非共價鍵結合而成的平面對稱五聚體CRP，分子量約120 kDa。值得注意的是，Potempa等[21-22]發(fā)現當天然CRP暴露于尿素、酸液、加熱等環(huán)境下或直接包被于聚乙烯板上時，天然五聚體CRP會解聚成單體CRP，表現出不同于天然CRP的“neo-CRP”的獨特抗原性。而且Ying等[20]證實5類識別表位不同的CRP單抗結合天然五聚體 CRP和單體 CRP的能力不同，提示建立檢測血漿中天然CRP的hs-CRP診斷試劑盒需使用構象正確的CRP抗原及其單抗，確保所使用的CRP單抗能夠識別血清中天然CRP。本研究曾試圖利用原核表達系統(tǒng)表達CRP基因，結果得到的是單體 CRP，目前也尚無研究報道利用基因工程重組表達技術成功表達出天然五聚體 CRP，而且后續(xù)利用單體CRP制備的單抗也不能捕獲血清中的天然五聚體CRP，進一步證實制備天然CRP的必要性。本研究利用天然五聚體CRP在鈣離子幫助下能與配體磷酸膽堿(PC)特異結合的特點[23]，使用 PC-Gel親和層析介質從肝硬化病人腹水中提取出高豐度的天然五聚體 CRP，進而利用離子交換層析方法得到高純度的天然CRP，建立了一種獲得天然CRP的方法，解決了購買進口CRP蛋白價格昂貴的困擾，大大降低后續(xù)CRP單抗的制備成本，目前市場上純度約95%的進口CRP蛋白的價格約為￥3 000/mg。

為了獲得能夠特異捕獲天然CRP的單抗，本研究參照文獻[20]建立了基于 PC-BSA的配體捕獲ELISA，該方法能夠很好地篩選出特異性結合天然CRP的單抗，為后續(xù)篩選最佳的雙抗體夾心配對單抗奠定了原料基礎。值得注意的是，多數CRP單抗在Western blotting實驗中不反應，提示天然CRP的優(yōu)勢表位可能以構象表位居多。單抗10C11在配體捕獲ELISA和Western blotting中均有很強的反應性，提示天然CRP表面可能存在一個優(yōu)勢線性表位，這對建立診斷試劑具有重要意義，而后續(xù)單抗配對篩選中也證實10C11作為標記單抗具有良好的檢測效果?？傊狙芯恐苽涞奶烊籆RP特異性單抗為建立hs-CRP診斷試劑盒解決了關鍵的原料來源，有助于降低我國hs-CRP診斷試劑盒的生產成本，促進臨床上早日廣泛開展hs-CRP指標檢測。

本研究建立的高敏C反應蛋白化學發(fā)光定量檢測方法(hs-CRP CLIA)采用國際CRP標準品CRM 470(WHO IS 85/506)進行校準，數據顯示 hs-CRP CLIA檢測特異性良好，靈敏度高，可重復性好，而且定量檢測線性范圍較寬，能夠定量檢測 0.04～20.38 mg/L范圍內人血清CRP標準品，可鑒別濃度大于10 mg/L的慢性炎癥。2003年美國疾病預防控制中心和美國心臟學會聯(lián)合發(fā)布了一個評估歐美人群心臟病發(fā)病風險高低的血清CRP水平為：CRP在1 mg/L以下為低風險、CRP在1～3 mg/L為中等風險、3～10 mg/L為高風險[7]。但是，由于中西方存在人種、健康狀況、飲食和生活習慣等不同，可能導致我國人群的CRP標準高于或低于歐美人群[24]。因此，本研究建立的hs-CRP CLIA由于具有較廣的線性檢測范圍，將有利于開展我國人群大規(guī)模的血清學調查研究，以制定出一個適合我國人群心臟病風險預測的 CRP評估標準。另外，本研究建立的hs-CRP CLIA與美國BIOCHECK的hs-CRP ELISA試劑盒相比，兩者檢測結果具有良好的可比性，值得一提的是hs-CRP CLIA檢測時無需稀釋待測血清樣品，在操作上比BIOCHECK ELISA方法更方便。

總之，本研究建立的hs-CRP CLIA是一種準確、可靠、可定量的高敏CRP檢測方法，有利于我國各級醫(yī)院和臨床單位廣泛開展hs-CRP指標檢測，有利于提高我國心臟病風險預測水平。

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Chemiluminescent immunoassay for high-sensitivity C-reactive protein

Pingguo Liu1*, Guoqiang Li2*, Yixin Chen2, Haifeng Luo2, Dedang Huang2, YingbinWang2,Shengxiang Ge2, Jun Zhang2, and Ningshao Xia2
1 Department of Hepatobiliary Surgery, Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen 361004, China 2 National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005,China

Received:February 3, 2010;Accepted:April 12, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program(863 Program)(No.2006AA020905), Fujian Medical Innovation Program(No.2009-CXB-55).

Corresponding author:Yixin Chen.Tel: +86-592-2188393; Fax: +86-592-2181258; E-mail: yxchen2008@xmu.edu.cn*These authors contributed equally to this work.國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2006AA020905)，福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題(No.2009-CXB-55)資助。