張金龍，任軍，李冰，劉樹玲，侯利華，付玲，李建民，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

黃曲酶尿酸氧化酶突變體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及生物學(xué)活性分析

張金龍，任軍，李冰，劉樹玲，侯利華，付玲，李建民，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

采用融合PCR的方法將黃曲霉尿酸氧化酶(UOX)基因的307～309 bp的TGC(Cys)突變?yōu)镚CC(Ala)，將所獲得的突變體基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-42a(+)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，突變體蛋白(UOX-Ala103)得到高水平的可溶性表達(dá)，目的蛋白占總蛋白含量的45%。疏水柱及陰離子柱純化后，UOX-Ala103蛋白純度＞98%。Western blotting分析證實(shí)UOX-Ala103能與抗UOX單抗特異結(jié)合。與天然型相比較，其體外生物學(xué)活性增加約60%，在高尿酸血癥小鼠模型體內(nèi)也有良好的降解尿酸的活性。

黃曲霉尿酸氧化酶，突變體，半胱氨酸，表達(dá)，純化，生物活性

Abstract:We converted the TGC codon(307–309 bp)ofAspergillus flavusurate oxidase(UOX)gene to a GCC codon by using fusion PCR techniques to produce a C103A mutant.This gene was cloned into expression vector pET-42a(+)and then transformed intoEscherichia coliBL21(DE3).The mutant protein(UOX-Ala103)was expressed in soluble form at high levels after induction with IPTG.The expressed rUOX-Ala103accounted for about 45% of total bacterial proteins.rUOX-Ala103of up to 98% purity was obtained after purified using hydrophobic interaction and anion exchange.Western blotting showed that the anti-UOX antibody specifically recognized rUOX-Ala103.The mutant protein showed a 60% increasedinvitrobiological activities compared with native protein, and performed a good activity of degrading the uric acidinvivo.

Keywords:urate oxidase(UOX), mutant, cysteine, expression, purification, biological properties

尿酸氧化酶(Uricase，EC1.7.3.4)是生物體內(nèi)嘌呤代謝的關(guān)鍵酶，它能夠催化尿酸氧化形成尿囊酸。許多物種體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有尿酸氧化酶，但是鳥類和一些高級(jí)靈長類動(dòng)物體內(nèi)卻缺乏此酶，而以尿酸作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物。尿酸及其鹽類在血液中溶解度很低，而尿酸在體內(nèi)的累積導(dǎo)致了痛風(fēng)癥[1-6]。直接從黃曲霉提取的尿酸氧化酶(Uricozyme?)和用酵母表達(dá)的重組黃曲霉尿酸氧化酶 Rasburicase(Fasturtec?/Elitek?)均已經(jīng)成功應(yīng)用于控制接受化療的病人的尿酸水平。但UOX的活性會(huì)在純化過程中降低。質(zhì)譜分析表明活性降低的 UOX的 Cys103有一個(gè)通過二硫鍵連接的半胱氨酸加合物。這一現(xiàn)象可能導(dǎo)致了黃曲霉尿酸氧化酶的活性下降[7]。黃曲霉尿酸氧化酶共有Cys35、Cys103、Cys290三個(gè)半胱氨酸，且在正常情況下均不形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃曲霉尿酸氧化酶的 Cys103基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，將其突變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)上只比Cys少一個(gè)硫原子的Ala，隨后成功地表達(dá)純化了該突變體蛋白(UOX-Ala103)。并且在免疫原性、體外活性、及體內(nèi)活性等方面與天然型(UOX-Cys103)進(jìn)行了對(duì)比。研究了半胱氨酸殘基對(duì)UOX催化活性的影響，從而為 UOX的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供相關(guān)有用的信息。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株E.coliBL21(DE3)、菌株E.coliDH5α、原核表達(dá)載體pET-42a(+)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；Pyrobest Taq、ExTaq、pMD-18T載體購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DEAE-Sepharose FF、Phenyl Sepharose FF和 Phenyl Sepharose HP 填料購自GE公司；抗UOX的單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自行制備；酵母提取物和蛋白胨購自Gibco-BRL公司；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 UOX-Ala103的定點(diǎn)突變

根據(jù) GenBank公布的序列(Accession No.X61776)利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)4條引物(表1)，其中AU-UP及AU-LOWER中的下劃線部分為引入的NdeI及Hind III酶切位點(diǎn)，AU103-LOWER中的下劃線部分為所突變的位點(diǎn)，由原序列的GCA突變?yōu)?GGC，相應(yīng)的半胱氨酸被突變?yōu)楸彼?。AU-103UP及AU103-LOWER中的陰影部分是為了方便拼接而設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列。采用兩輪擴(kuò)增：第 1輪為突變，分上下游2個(gè)片段進(jìn)行。模板為本室保存的含有UOX的cDNA的pMD-UOX質(zhì)粒[8]，所采用聚合酶為Pyrobest Taq，引物對(duì)分別為：上游片段(C103A-UP)：AU-UP/AU-103-LOWER；下游片段(C103A-LOWER)：AU-103-LOWER/AU-LOWER。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min ；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min?；厥誔CR產(chǎn)物后進(jìn)行第2輪PCR融合上下游片段：所采用模板為 C103A-UP+C103A-LOWER；引物對(duì)為 AU-UP/AU-LOWER；聚合酶為Ex Taq；PCR反應(yīng)條件同上輪。PCR結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段。

表1 定點(diǎn)突變PCR引物Table 1 PCR primers of site-directed mutagenesis

1.2.2 構(gòu)建測序載體

凝膠回收后連接pMD-18T載體：16℃連接2 h，然后轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選，挑取克隆做菌落PCR鑒定，并用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后用NdeI/Hind III作雙酶切鑒定，將符合預(yù)期結(jié)果的陽性克隆送英駿北京公司測序。

1.2.3 構(gòu)建表達(dá)載體

測序正確的菌株提取的質(zhì)粒及 pET-42a(+)載體進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠回收并純化目的基因片段，再和載體片段后按一定比例混合后加入T4 DNA連接酶，16℃連接2 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選，挑取克隆做菌落PCR鑒定，并用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后用NdeI/Hind III作雙酶切鑒定，結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒編號(hào)為pET42a-UOX-Ala103。并將之轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21(DE3)。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)

挑單克隆接種到2 mL含有卡那霉素(30 μg/mL)的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。次日，取0.2 mL接種到裝有5 mL新鮮LB培養(yǎng)基的玻璃試管內(nèi)，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600≈1.0時(shí)，加入濃度為0.6 mmol/L的IPTG，37℃、200 r/min培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)5 h后8 000 r/min離心10 min收集菌體，用1 mL PBS(pH 7.2)重懸后超聲破碎，12 000× g離心15 min后分全菌、上清、沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析表達(dá)情況及可溶性。

1.2.5 破菌及純化

挑單克隆接種到50 mL含有卡那霉素(30 μg/mL)的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。次日，取20 mL接種到裝有1 L新鮮LB培養(yǎng)基的容量為 5 L的玻璃搖瓶中，誘導(dǎo)表達(dá)、收集菌體條件同1.2.3。收集到的菌體用 80 mL溶液 A(20 mmol/L PB，pH 7.2)重懸后超聲破碎、12 000× g離心15 min后取上清，加入1/2體積的溶液C(20 mmol/L PB，3 mol/L(NH4)2SO4，pH 7.2)之后上用溶液B(20 mmol/L PB，1 mol/L(NH4)2SO4，pH 7.2)預(yù)平衡的疏水層析柱(Phenyl Sepharose FF)，目的蛋白結(jié)合在層析柱上，溶液 B再平衡后，2個(gè)柱體積、0%A→100% A梯度洗脫；疏水層析洗脫蛋白用 G-25脫鹽柱(Hiprep 26/10 Desalting)脫鹽至溶液 D(20 mmol/L PB，0.075 mol/L NaCl，pH 8.0)后過陰離子層析柱(DEAE-Sepharose FF)，收集流穿液，加入 1/2體積的溶液 C，用疏水層析柱(Phenyl Sepharose HP)進(jìn)一步精純。精純后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 Western blotting分析

UOX-Ala103蛋白 SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上(用UOX-Cys103作參照)，用5%的脫脂奶粉封閉，室溫2 h；TBST洗3次，每次10 min，然后加一抗(1∶10 000 Anti-UOX)；37℃孵育 2 h后TBST洗3次，每次10 min，然后加二抗(1∶5 000 anti-rabbit IgG-HRP)；室溫孵育1 h后TBST洗3次，每次15 min，洗完后用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.7 體外和體內(nèi)活性分析

加 1 μg純化后的 UOX-Ala103到含有 0.3 μmol尿酸的4.5 mL的TEA緩沖液(7.5 g/L 三乙醇胺，0.38 g/L EDTA，pH 8.9)中，30℃條件下反應(yīng)5 min后加 0.5 mL的20% KOH終止反應(yīng)。通過檢測292 nm處吸光度值的下降所反映的尿酸濃度的降低，從而得出酶的活性。酶活性定義：在pH 8.9、30℃條件下，每分鐘催化1 μmol尿酸氧化所需的酶量為一個(gè)單位[8]。

40只雄性BLAB/C小鼠，體重22～24 g。10只腹腔注射0.5 mL生理鹽水(含0.5%羧甲基纖維素鈉)，不給尿酸氧化酶作為空白對(duì)照。30只腹腔注射含尿酸(按1 000 mg/kg體重計(jì))及羧甲基纖維素鈉的生理鹽水 0.5 mL。其中 10只尾靜脈注射UOX-Ala103(按0.2 mg/kg體重計(jì))；10只尾靜脈注射等量的同等條件下純化的(UOX-Cys103)，剩余 10只不給藥作為模型組。給藥后分1 h、2 h、4 h尾靜脈采血，7 500 r/min、10 min離心取血清檢測尿酸含量。應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用One-Way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UOX-Ala103的基因突變、融合及重組質(zhì)粒的鑒定

以pMD-UOX質(zhì)粒為模板的第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見上游片段和下游片段分別在約300 bp和600 bp附近有擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期相符(圖1)。第2輪PCR融合得到長約903 bp的片段，與預(yù)期目標(biāo)一致(圖1)。測序結(jié)果與GenBank公布的黃曲霉尿酸氧化酶序列進(jìn)行比對(duì)，其序列的307～309 bp的TGC(Cys)突變?yōu)镚CC(Ala)，突變成功。所構(gòu)建的 pET42a-UOX-Ala103質(zhì)粒經(jīng)NdeI/Hind III雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果得到長約903 bp的片段(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 UOX-Ala103定點(diǎn)突變Fig.1 The site-directed mutagenesis of UOX-Ala103gene by fusion PCR.1: AU103-UP; 2: AU103-LOWE; 3: UOX-Ala103;M1 and M2: DNA marker.

圖2 質(zhì)粒pET42a-UOX-Ala103Nde I/Hind III雙酶切鑒定Fig.2 Identification of plasmid pET42a-UOX-Ala103by the double enzyme digestion ofNdeI/Hind III.1: plasmid pET42a-UOX -Ala103; 2: pET42a-UOX-Ala103digested withNdeI/Hind III; M: DNA marker.

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性鑒定

所構(gòu)建的表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破菌，離心后將全菌、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后在約34 kDa處出現(xiàn)一條明顯的條帶，約占全部菌體蛋白的45%，且絕大多數(shù)在上清中。說明重組UOX-Ala103誘導(dǎo)表達(dá)成功。并主要以可溶性形式存在。與未經(jīng)突變的重組UOX-Cys103一致(圖3)。

圖3 SDS-PAGE分析UOX-Ala103表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of UOX-Cys103expression.1–4:UOX-Cys103; 5–8: UOX-Ala103; 1 and 5: total bacterial protein without induction; 2 and 6: total of the bacterial lysate after induction; 3 and 7: supernatant of the bacterial lysate after induction; 4 and 8: pellet of the bacterial lysate after induction;M：protein marker.

2.3 純化結(jié)果SDS-PAGE及Western blotting分析結(jié)果

誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破碎離心后的上清經(jīng)三步純化，得到純度大于98%的UOX-Ala103重組蛋白(圖4A)。Western blotting分析結(jié)果證明其能夠與抗UOX的單克隆抗體特異結(jié)合(圖4B)。

圖4 三步純化后的UOX-Ala103蛋白的SDS-PAGE分析(A)及Western blotting分析(B)Fig.4 SDS-PAGE analysis and of UOX-Ala103 Western blotting analysis after three-step purification.(A)SDS-PAGE analysis.1–8: UOX-Ala103after three-step purification; M:protein marker.(B)Western blotting analysis.1: UOX-Cys103;2: UOX-Ala103.

2.4 體外和體內(nèi)活性分析結(jié)果

按照1.2.6所述方法測定，純化后的UOX-Ala103比活力為 20.14 IU/mg，同等條件下表達(dá)純化的UOX-Cys103比活力為12.62 IU/mg，103位的Cys突變?yōu)?Ala之后比活增加了 59.57%。體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，相對(duì)于空白組，模型組的小鼠血清中的尿酸的含量在各時(shí)間點(diǎn)均有很大提高(1 h，2 h：P＜0.01；4 h：P＜0.05)，造模成功。與模型組相比較，UOX-Cys103及UOX-Ala103組的小鼠血清中的尿酸含量下降明顯(各時(shí)間點(diǎn)P＜0.001)，證明二者均有降低高尿酸血癥模型小鼠體內(nèi)尿酸的作用，UOX-Cys103與 UOX-Ala103相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異，在本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)未能觀測到 UOX的Cys103→Ala103突變后對(duì)體內(nèi)活性的影響。

表2 注射UOX后小鼠體內(nèi)的尿酸濃度(x ±s，μmol/L)Table 2 Concentration of uric acid in mouse after UOX was injected(x ±s, μmol/L)

3 討論

黃曲霉尿酸氧化酶的活性形式是由 4個(gè)分子量約為34 kDa的單體組成的同四聚體，4個(gè)亞基圍在一起形成了一個(gè)隧道式結(jié)構(gòu)。整個(gè)結(jié)構(gòu)好像一個(gè)高70 ?、外徑約為60 ?、內(nèi)徑約為12 ?的桶。四聚體的穩(wěn)定主要靠接觸面上的反向平行的β折疊主鏈原子之間的氫鍵維系。每個(gè)四聚體含有4個(gè)活性中心，由 Phe159、Arg176、Gln228、Asn254、His256及相鄰的亞基的 Lys10、Thr57組成[9-13]，用Launch Discovery Studio軟件對(duì)UOX的晶體結(jié)構(gòu)(1R56.pdb)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)四聚體內(nèi)的活性位點(diǎn)位于2個(gè)相鄰亞基之間的交界處(圖5)，故推測其活性對(duì)四聚體的結(jié)構(gòu)變動(dòng)較為敏感。UOX含有3個(gè)半胱氨酸Cys35、Cys103、Cys290，晶體結(jié)構(gòu)表明，其中Cys35、Cys290的硫原子朝向四聚體孔道的內(nèi)部，與溶液中的游離半胱氨酸接觸幾率很小，純化后的成品中此2個(gè)位置不含Cys加合物。而Cys103的硫原子朝向四聚體的外表面(圖6)，與溶液中的游離半胱氨酸接觸機(jī)率很大。所以UOX-Cys103在制備過程中，Cys103會(huì)與游離的 Cys通過二硫鍵結(jié)合，使之多出一個(gè)Cys加合物，從而引起等電點(diǎn)降低、極性增加、活性下降等現(xiàn)象[7]。本研究中將Cys103突變?yōu)閭?cè)鏈不含硫原子的Ala，所以純化后的蛋白質(zhì)中不含Cys加合物，從而使其在體外活性增加。體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)中，二者在體內(nèi)降解尿酸的能力相當(dāng)，原因可能是因?yàn)轶w內(nèi)環(huán)境下沒有維系二硫鍵的有利氧化勢，這種非正常的二硫鍵會(huì)在二硫化物異構(gòu)酶的作用下解開，消除了Cys加合物對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響，也有可能是因?yàn)樗捎玫臉?biāo)準(zhǔn)劑量(0.2 mg/kg體重)對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來說過高，所以掩蓋了二者的差異，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖5 UOX活性位點(diǎn)與四聚體中各亞基的位置關(guān)系Fig.5 Relative position of active site with subunits in the tetramer.Amino acids constituted active site is shown in yellow.The A subunit is shown in blue.The B subunit is shown in brown.

圖6 UOX一個(gè)亞基中的半胱氨酸在四聚體中的位置Fig.6 Representation of one monomer’s cysteine in the tetramer.The cysteine is shown in yellow.

黃曲霉尿酸氧化酶是罕見的隧道式蛋白(Tunneling-fold protein)家族4個(gè)成員中最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)，其中心孔道的作用至今尚不明確[12]。而黃曲霉尿酸氧化酶的催化相對(duì)于其他的氧化還原酶類是十分獨(dú)特的，因?yàn)樗鼪]有金屬離子或其他的輔基參與到電子傳遞之中[9]。其催化機(jī)理還存在很多的爭議。本研究通過突變的方法獲得了體外活性比野生型更高的UOX-Ala103突變體，可以使其在尿酸的各種體外檢測中更加有效。另外，本研究為從結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步研究隧道式蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系及黃曲霉尿酸氧化酶的催化原理打下基礎(chǔ)。

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Construction, expression, purification and characterization of mutant of Aspergillus flavus urate oxidase

Jinlong Zhang, Jun Ren, Bing Li, Shuling Liu, Lihua Hou, Ling Fu, Jianmin Li, and Wei Chen
State Key Laboratory of Pathogens and Biosecurity, Laboratory of Applied Molecular Biology, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received:February 26, 2010;Accepted:April 19, 2010

Corresponding author:Jianmin Li.Tel: +86-10-66948692; Fax: +86-10-63815273; E-mail: ljmqz@yahoo.com.cn Wei Chen.Tel: +86-10-66948565; Fax: +86-10-63815273; E-mail: cw789661@yahoo.com