張雪花，鄭其升，陳瑾，薛剛，侯紅巖，侯繼波

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095

展示生長抑素的豬細小病毒樣顆粒構(gòu)建及其免疫原性

張雪花1,2，鄭其升1，陳瑾1，薛剛1,2，侯紅巖1，侯繼波1

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095

為了獲得既可預(yù)防豬細小病毒感染又能促進生長的嵌合病毒樣顆粒疫苗，以PPV NJ-a株基因組DNA為模板擴增VP2基因片段，在VP2基因N端融合人工合成的4拷貝生長抑素基因，構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2。通過轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，pFast-SS4-VP2與穿梭載體Bacmid重組，獲得重組Bacmid，命名為rBacmid-SS4-VP2。rBacmid-SS4-VP2轉(zhuǎn)染Sf-9細胞，獲得重組病毒rBac-SS4-VP2。SDS-PAGE與Western blotting鑒定可見約68 kDa的rSS4-VP2條帶；rBac-SS4-VP2感染細胞IFA檢測產(chǎn)生很強的特異性綠色熒光；感染細胞超薄切片電鏡觀察到大量特征性病毒樣顆粒。將重組蛋白分別輔以鋁膠、IMS和白油不同佐劑免疫小鼠，通過檢測免疫小鼠VP2特異性ELISA抗體、PPV特異性中和抗體、生長抑素的抗體水平及生長激素水平來評價嵌合病毒樣顆粒的免疫原性。結(jié)果表明，輔以鋁膠與IMS佐劑重組蛋白組均產(chǎn)生了與PPV全毒組相似的ELISA抗體與中和抗體反應(yīng)；重組蛋白免疫組均產(chǎn)生較好的針對生長抑素的抗體反應(yīng)；免疫小鼠體內(nèi)生長激素的水平明顯升高；其中以鋁膠佐劑組產(chǎn)生的各抗體水平最高，白油佐劑組各抗體水平最低。為以后生產(chǎn)安全、有效的顆?；瘉唵挝灰呙缣峁┝艘粋€新的設(shè)計思路，又為應(yīng)用病毒樣顆粒遞呈外源肽，從而生產(chǎn)多聯(lián)亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

豬細小病毒，VP2蛋白，生長抑素，桿狀病毒，病毒樣顆粒

Abstract:In order to obtain a virus-like particle vaccine both for porcine parvovirus(PPV)prevention and growth-promotion,VP2gene of PPV NJ-a strain was amplified with PCR, and four copies of synthetic somatostatin gene were fused to the N-terminal ofVP2gene.The fused gene was cloned into pFast-HT A to construct the recombinant plasmid pFast-SS4-VP2, then the pFast-SS4-VP2was transformed into DH10Bac competent cells and recombined with shuttle vector Bacmid, followed by identification with blue-white screening and PCR analysis for three cycles, and the positive recombinant was named as rBacmid-SS4-VP2.The positive Sf-9 cells were transfected with rBacmid-SS4-VP2by Lipofectamine to produce recombinant baculovirus.When the cytopathic effect(CPE)was obvious, the transfected Sf-9 cell was harvested, and the positive recombinant virus was named as rBac-SS4-VP2.Theinsertion for the target gene into baculovirus genome was confirmed with PCR.SDS-PAGE and Western blotting revealed that the calculated protein of approximately 68 kDa was in the expressed in the insect cells.The Sf-9 cells infected with rBac-SS4-VP2 were stained positive against PPV antibody using the indirect immunofluorescence assay(IFA).Moreover, the virus particle self-assembly was observed under electron microscopy.90 four-week-old mice were immunized by the recombinant protein coupled with different adjuvants alhydrogel, IMS and oil.VP2-specific ELISA antibodies, PPV-specific neutralizing antibody, somatostatin antibody and growth hormone levels were examined to evaluate the immunogenicity of this virus like particle.Results indicated that mice groups immunized rSS4-VP2 protein with alhydrogel and IMS developed similar humoral immune response comparing with inactived PPV vaccine.Mice group immunized with rSS4-VP2 generated higher level of SS antibody and growth hormone comparing with negative control, mice receiving rSS4-VP2 with alhydrogel developed the highest antibody titre than all other groups, while the oil group developed the lowest antibody level.This study provides not only a new rout for production of safe and effective virus like particle subunit vaccine, but also the foundations for peptide presentation and multivalent subunit vaccine design.

Keywords:porcine parvovirus, VP2, somatostatin, baculovirus, virus-like particles

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的主要病原之一，導(dǎo)致初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，其中以胎兒木乃伊化為主，成年豬不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。在PPV組織培養(yǎng)物中，完整病毒粒子與不含DNA的空衣殼病毒粒子同時存在，大小形態(tài)相同，密度分別為 1.39 g/cm3和1.33 g/cm3[2]。Choi等報道，PPV空衣殼可影響病毒在傳代細胞和豬體內(nèi)的增殖。體內(nèi)外試驗表明，抑制作用依賴于空衣殼所占比例，當(dāng)空衣殼與全病毒的比例超過30∶1時，接種的豬不表現(xiàn)臨床癥狀，但DNA雜交顯示有病毒存在的跡象[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫接種是防治該病的關(guān)鍵，許多學(xué)者成功研制了相應(yīng)的滅活疫苗和弱毒活疫苗。此外，Martinez等還證實，體外表達的PPV VP2蛋白具有良好的免疫原性，免疫動物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)，與商品化疫苗的免疫效果相同[4]。

PPV屬于自主型細小病毒，其基因組為線狀單股負鏈DNA，大小約為5 kb，共有2個開放閱讀框架(Open reading frame，ORF)，一個編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2)，另一個編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2和 NS3)其中 VP2是構(gòu)成病毒粒子的主要衣殼蛋白，具有血凝活性，約占病毒衣殼蛋白總量的80%，VP2蛋白攜帶主要的抗原決定簇，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性中和抗體，VP2對病毒感染、發(fā)揮其致病性方面亦起關(guān)鍵作用。并且VP2蛋白在體外表達時可自主裝配，能自動形成完整的病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性，成為病毒疫苗研究的主要方向[5]。病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白裝配成的空心顆粒，它既具有類似天然病毒的穩(wěn)定性和免疫原性，又具備攜帶外源蛋白或多肽的潛能，不含有病毒的核酸沒有感染性，使其有望成為構(gòu)建多價疫苗的良好載體[6-8]。據(jù)報道，使用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了PPV的病毒樣顆粒，該 VLPs能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答[9-10]。而在VP2基因的 5′端連接一段外源基因?qū)PV VLPs的形成影響較小[11]。

生長抑素(Somatostatin，SS)是下丘腦釋放的14氨基酸的小肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道組織中。SS能抑制生長激素(GH)的分泌，而GH處于動物生長軸的核心，GH通過與受體結(jié)合誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生胰島素樣生長因子(IGF-1)，而IGF-1能直接作用于動物體內(nèi)的多種組織，促進蛋白質(zhì)的合成，促進細胞增殖，從而促進骨骼、肌肉和內(nèi)臟的生長[12]。由于SS是一個只有14個氨基酸的小肽，在體內(nèi)穩(wěn)定性較差，需要承載于其他大的蛋白載體，才能更好地發(fā)揮免疫原性。

本研究以豬細小病毒VP2蛋白為載體，在其N端插入4拷貝生長抑素，用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得自我裝配的病毒樣顆粒，以期獲得既可預(yù)防豬細小病毒病又能促進生長的雙價亞單位疫苗。為了提高抗原的免疫原性，使機體產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答。本實驗以白油、鋁膠、IMS 1312、CpG為佐劑設(shè)計了不同的免疫組，旨在篩選出比較適合的佐劑來提高抗原的免疫效力。

1 材料與試劑

1.1 菌株、質(zhì)粒、毒株與細胞

轉(zhuǎn)座用大腸桿菌宿主菌 DH10Bac(含桿狀病毒穿梭載體質(zhì)粒Bacmid和輔助質(zhì)粒Helper)、pFastBac HT A、草地貪夜蛾卵巢細胞Sf-9由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所王芳老師惠贈；四拷貝的生長抑素基因由大連TaKaRa公司人工合成；大腸桿菌DH5α、PK-15細胞、豬細小病毒強毒株(NJ-a株)由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 主要試劑

Grace′s培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(FBS)、Sf-900 ⅡSFM 無血清培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2 000均購自Invitrogen公司；BamHⅠ、XhoⅠ工具酶，DNA Marker DL 2 000、15 000、λ-HindⅢ、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、T4 DNA連接酶、Ex TaqDNA聚合酶、DNA膠回收試劑盒購自大連TaKaRa公司；蛋白Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen公司；豬細小病毒抗體檢測試劑盒購自深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司；生長激素放射免疫分析檢測試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；豚鼠抗PPV陽性血清實驗室保存；HRP與FITC標(biāo)記羊抗豚鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自博士德生物工程公司；人工合成的生長抑素由上海吉爾生化有限公司合成；鋁膠由南京天邦公司提供；IMS 1312購自法國賽比克公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計與合成

以PPV NJ-a株為模板，用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計出 2條引物(表 1)，用于擴增VP2全基因。

人工合成四拷貝豬生長抑素基因，帶有BamHⅠ、BlgⅡ酶切位點GGATCCAAAAAGCTGG TTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTC TTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGAC TTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTT TTGGAAGACTTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAA GAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGTAG ATCT。

2.2 重組質(zhì)粒pFast-SS4-VP2構(gòu)建

以P1、P2為引物擴增PPVVP2，PCR產(chǎn)物克隆入 pMD18-T載體，獲得質(zhì)粒 pMD-VP2，進行序列測定，確定基因序列的正確性。

將人工合成的四拷貝生長抑素基因用BamHⅠ、BlgⅡ雙酶切鑒定，送測序進一步驗證基因序列。

利用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒 pMD-VP2，回收VP2片段，克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HT A，得到重組質(zhì)粒pFast-VP2。

BamHⅠ單酶切重組質(zhì)粒 pFast-VP2，使其完全線性化后，CIAP去磷酸化，回收。BamHⅠ、BlgⅡ雙酶切人工合成的四拷貝生長抑素，獲得的四拷貝生長抑素片段與線性化的pFast-VP2進行連接，獲得重組質(zhì)粒pFast-SS4-VP2。

2.3 重組穿梭載體 rBacmid-SS4-VP2的構(gòu)建和鑒定

按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作說明，將重組質(zhì)粒pFast-SS4-VP2轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，在DH10Bac中在helper質(zhì)粒輔助作用下重組質(zhì)粒pFast-SS4-VP2與Bacmid發(fā)生位點特異性轉(zhuǎn)座作用。在含有IPTG/X-gal、Kan、Gen及Tet抗生素的LB固體平板中出現(xiàn)藍白菌落，經(jīng) 3次藍白斑篩選，利用通用引物PUC/M13F和針對目的基因SS4-VP2的引物進行 PCR鑒定得到純化的rBacmid-SS4-VP2。

表1 用于PCR擴增的引物Table 1 Primers used for PCR amplification

2.4 重組桿狀病毒的制備和鑒定

按照 LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將重組穿梭載體 rBacmid-SS4-VP2轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf-9(10% FBS Grace′s培養(yǎng)液培養(yǎng))細胞，27℃靜置培養(yǎng)5 d以上，直至細胞出現(xiàn)病變，獲得的重組病毒命名為rBac-SS4-VP2。

PCR鑒定：從感染重組桿狀病毒的Sf-9細胞中提取總DNA，分別用通用引物PUC/M13F，特異性引物擴增目的片段。

2.5 重組桿狀病毒滴度的測定

按常規(guī)方法測重組桿狀病毒的滴度，病毒用2% FBS Grace′s 依次倍比稀釋至最高稀釋度 10?10；每個病毒稀釋度做8個平行復(fù)孔，加樣時從最高稀釋度開始；第11列和12列作為陰性對照，陰性對照孔中加入 100 μL 2% FBS Grace′s；于 27℃培養(yǎng)，每天觀察病變情況，直至對照細胞老化、脫落；計錄每一列中出現(xiàn)陽性的孔數(shù)；按Karber法計算結(jié)果。

2.6 重組蛋白在Sf-9細胞中的表達及檢測

2.6.1 SDS-PAGE電泳分析

重組病毒分別以MOI 0.01、0.05、0.1、0.5感染處于對數(shù)生長期Sf-9(Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)液培養(yǎng))細胞，同時以野生桿狀病毒為對照。感染后96～120 h待細胞病變明顯時收集細胞，用PBS洗3次，適量PBS重懸，加入 5×SDS Loading Buffer，用 10%SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2.6.2 Western blotting檢測

SDS-PAGE方法同上；半干法轉(zhuǎn)印，DAB顯色，拍照留圖。

2.6.3 間接免疫熒光檢測

重組病毒以MOI 0.5感染長滿Sf-9單層的6孔板，同時設(shè)立未感染的Sf-9昆蟲細胞和野生桿狀病毒感染的細胞作對照；待 6孔板內(nèi)的細胞完全病變后，棄上清，用75%的酒精固定40～60 min；用含1% BSA的 PBS洗3次，自然風(fēng)干；加入1∶100稀釋的豚鼠抗 PPV陽性血清(已與野生桿狀病毒蛋白作用過)，37℃濕盒孵育2 h；用含1% BSA的PBS洗3次，自然風(fēng)干；加入1:50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗豚鼠二抗，37℃作用30 min；用含1% BSA的PBS洗3次，自然風(fēng)干；熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.6.4 電鏡觀察

以MOI 0.5感染Sf-9細胞，120 h待細胞完全病變后收毒，用PBS洗3次，2 000 r/min離心10 min沉淀細胞，2.5%戊二醛(0.1 mol/mL 磷酸緩沖液pH 7.4)固定液4℃固定過夜，制備超薄切片，電鏡觀察。

2.7 重組蛋白的純化

重組病毒以MOI 0.05感染處在對數(shù)生長期的Sf-9細胞，5 d后收集病變細胞，用PBS洗2次，2 000 r/min離心15 min，重懸于25 mmol/L NaHCO3(pH 8.3)中，使細胞密度為2×107cells/mL，超聲波裂解后，10 000 r/min離心15 min，上清液中含有表達的 rSS4-VP2蛋白。收集上清中加入飽和硫酸銨(pH 7.0)至終濃度20%，4℃攪拌過夜進行沉淀，然后18 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于PBS中，加Triton X-100和TBP-磷酸三丁酯至濃縮物的1%和0.3%滅活桿狀病毒，室溫靜置30 min，透析除鹽，再用超濾管超濾離心，去除雜蛋白，即得到重組蛋白的純化物[13]。

2.8 小鼠免疫試驗

2.8.1 試驗設(shè)計

小鼠隨機分組，每組10只，具體設(shè)計見表2。

2.8.2 免疫程序

免疫3次，每次免疫時間間隔為2周。免疫200 μL/只，后腿各注射100 μL，每只小鼠重組蛋白免疫劑量為50 μg。免疫后每周小鼠眼球采血，常規(guī)分離血清，?20℃保存待用。

2.9 抗體檢測

2.9.1 豬細小病毒檢測試劑盒檢測抗體

具體操作步驟按試劑盒附帶說明書：用樣品稀釋液將血清 1∶40稀釋后加入預(yù)包被的微孔板中，每孔加 100 μL；同時設(shè)置陰、陽性對照孔，每孔加100 μL；另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加100 μL稀釋液。OD630測定結(jié)果。

2.9.2 免疫小鼠中和抗體的檢測

采用固定病毒稀釋血清法進行微量中和試驗檢測。其中血清無菌處理后作 2?1、2?2、2?3……系列倍比稀釋，接種于長滿 PK-15 細胞單層的 96孔板中，每孔50 μL。然后每孔加入用DMEM(GIBCO)稀釋為200 TCID50的PPV NJ-a株50 μL，同時設(shè)細

表2 試驗動物分組與疫苗制備Table 2 Animal grouping and treatment

胞對照和病毒對照孔，37℃、2% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察并記錄細胞病變結(jié)果，以能完全保護細胞不發(fā)生病變的最高稀釋倍數(shù)為被檢血清中 PPV特異性中和抗體的效價。

2.9.3 間接ELISA檢測生長抑素抗體水平

以人工合成的生長抑素(5 μg/mL)為抗原包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，2免后2周的小鼠血清為一抗1∶100稀釋，檢測血清抗生長抑素抗體水平。

2.9.4 GH水平檢測

取100 μL 2免后2周的小鼠血清，送南京軍區(qū)總醫(yī)院檢測生長激素(GH)含量。

3 結(jié)果

3.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及酶切鑒定

載體pFast-HT A 用BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切，使之完全線性化，先與VP2相連，酶切鑒定正確后，BamHⅠ單酶切，去磷酸化后與生長抑素連接，酶切鑒定，并命名為pFast-SS4-VP2。由圖可以看到酶切后得到一條1 910 bp的條帶，與目的條帶大小相當(dāng)，證明重組載體構(gòu)建成功(圖1)。

3.2 重組穿梭載體的構(gòu)建與鑒定

將空載體pFast-HT A、重組載體pFast-SS4-VP2轉(zhuǎn)入含穿梭質(zhì)粒Bacmid的感受態(tài)細胞DHl0Bac中，在Helper質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶的協(xié)助下，重組轉(zhuǎn)移載體 pFast-SS4-VP2與 DHl0Bac發(fā)生位點特異性的轉(zhuǎn)座作用，將目的基因克隆入Bacmid，經(jīng)3次藍白菌落篩選及利用通用引物 PUC/M13PCR鑒定，空載體與Bacmid重組后擴增出的條帶大小為2 430 bp，重組載體與Bacmid重組后擴增出條帶大小為4 300 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion.1: DL15 000 DNA marker; 2?3: pFast-HT A plasmid digested byBamH I; 4: DL2 000 DNA marker; 5?6: pFast-SS4-VP2 recombinant plasmid digested byBamH I andXhoI.

圖2 PCR鑒定重組BacmidFig.2 Identification of the recombinant Bacmid by PCR.1:DL15 000DNA marker; 2: PCR product of rBacmid-pFast.

3.3 重組桿狀病毒的制備

轉(zhuǎn)染后每天觀察細胞狀態(tài)，對照細胞生長良好，輪廓清晰，胞體明亮，能看到明顯的細胞分裂，增殖的啞鈴型細胞，轉(zhuǎn)染重組病毒的細胞開始沒有明顯變化；3 d后，細胞開始變化，細胞變大變圓，細胞核充滿整個細胞，病變細胞隨著時間增加，感染重組病毒細胞生長停止，細胞中出現(xiàn)囊泡、病毒包涵體，折光率增加，最后早期感染的細胞開始死亡，有細胞脫落、破裂(圖3)。

圖3 重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2在Sf-9細胞上引起的細胞病變Fig.3 CPE on Sf-9 cells induced by rBac-SS4-VP2 infection.(A)Normal Sf-9 cell.(B)Sf-9 cell transfected with rBacmid-SS4-VP2.

3.4 重組桿狀病毒的PCR鑒定

提取病變細胞DNA基因組，分別以PUC/M13通用引物、特異性引物進行PCR擴增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見條帶與目的片段大小一致，且沒有出現(xiàn)雜帶，證明外源基因成功插入桿狀病毒基因中，并說明病毒已得到純化(圖4)。

圖4 重組桿狀病毒PCR鑒定Fig.4 Identification of the recombinant baculovirus by PCR.1: DL15 000 DNA marker; 2: PCR amplification with M13 primer for Bacmid transfected Sf-9 cells; 3: PCR amplification with M13 primer for rBacmid-pFast; 4: PCR amplification with M13 primer for rBac-SS4-VP2; 5: PCR amplification with specific primer for rBac-SS4-VP2; 6: DL2 000 DNA marker.

3.5 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定

分別以不同MOI 0.01、0.05、0.1、0.5感染Sf-9細胞，96 h后收集病變Sf-9細胞，用PBS洗滌3次后，加上樣緩沖液煮沸10 min后進行SDS-PAGE，結(jié)果表明，在lane2～5中均出現(xiàn)一條大小約為68 kDa的特異性蛋白質(zhì)條帶，與DNAStar分析的蛋白分子量基本一致，陰性對照(lane1)未出現(xiàn)該蛋白質(zhì)條帶，且不同的感染比感染細胞蛋白表達量相當(dāng)(圖5)。

3.6 重組蛋白的Western blotting鑒定

Western blotting檢測，以MOI 0.1、0.5感染細胞，制備樣品方法同SDS-PAGE，結(jié)果在lane2、lane3中出現(xiàn)特異性蛋白條帶，lane4中則沒有出現(xiàn)特異性條帶(圖6)，表明利用桿狀病毒表達的rSS4-VP2蛋白可與 PPV陽性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，從而證實其具有生物學(xué)活性。

圖5 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of rSS4-VP2 protein.1: wild baculovirus control; 2?5: Sf-9 cells infected with rBac-SS4-VP2 in the different MOI 0.01, 0.05, 0.1 and 0.5; 6: standard protein marker.

圖6 重組蛋白的Western blotting分析Fig.6 Identification of rSS4-VP2 protein by Western blotting.1: standard protein marker; 2?3: Sf-9 cells infected with rBac-SS4-VP2 in the different MOI 0.1 and 0.5; 4: wild baculovirus control.

3.7 間接免疫熒光檢測

分別將野生桿狀病毒、rBac-SS4-VP2重組桿狀病毒感染對數(shù)生長期細胞，待細胞完全產(chǎn)生病變后，用 75%乙醇固定細胞做間接免疫熒光，健康細胞Sf-9作對照。重組病毒與豬細小病毒豚鼠陽性血清特異性反應(yīng)，顯微鏡下觀察可見很強的綠色熒光，而野毒感染細胞只是在病變周圍存在很弱的非特異性熒光，健康細胞未檢測到熒光(圖7)。

3.8 電鏡觀察鑒定

取重組病毒感染120 h的細胞，戊二醛固定后，制備電鏡超薄切片進行電鏡觀察。發(fā)現(xiàn)在細胞中有大量聚集在一起的直徑約20～30 nm的球形顆粒，其形態(tài)大小均與 PPV的全病毒粒子相近，證實SS4-VP2重組蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中自我組裝成嵌合病毒樣顆粒(Chimeric Virus-Like Particles，CVLP)(圖8)。

圖7 重組病毒的IFA檢測Fig.7 Identification of the rSS4-VP2 protein expression by IFA.(A)Cells infected with rBac-SS4-VP2.(B)Cells infected with wild baculovirus.(C)Normal Sf-9 cells.

圖8 細胞中形成的病毒樣顆粒Fig.8 VLPs in Sf-9 cells.(A)Sf-9 cells infected with rBac-SS4-VP2 through electron microscopy.(B)Sf-9 cells infected with wild baculovirus through electron microscopy.

3.9 豬細小病毒檢測試劑盒檢測抗體結(jié)果

利用試劑盒檢測結(jié)果，免疫后 1周沒有檢測到抗體，2周可以檢測到抗體但含量偏低，2免后1周抗體逐漸升高，2免后 2周每組抗體明顯升高(圖9)。從總體的抗體水平來看，2免后2周PPV滅活苗組與重組蛋白組均產(chǎn)生了特異性抗體；從佐劑不同、抗原相同的組來看，抗體水平：Alhydrogel＞IMS＞CpG+Alhydrogel＞CpG+IMS＞Oil組，但差異不顯著；從佐劑相同、抗原不同的組比較看，抗體水平：PPV Inactivated vaccine＞rSS4-VP2＞rBac-SS4-VP2＞W(wǎng)ild Baculovirus。

3.10 PPV中和抗體的檢測結(jié)果

利用中和試驗檢測免疫小鼠血清中和抗體滴度以評價重組病毒免疫后產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，2免后2周每組血清中和抗體水平平均值(圖10)。在9個免疫組中，rSS4-VP2/Alhydrogel免疫組產(chǎn)生的中和抗體最高；PPV Inactivated vaccine/CpG+Alhydrogel組次之；rSS4-VP2/IMS，rSS4-VP2/CpG+IMS，rSS4-VP2/CpG+Alhydrogel免疫組所產(chǎn)生的中和抗體滴度相當(dāng)，但稍低于前 2組；rSS4-VP2/Oil最差；Wild Baculovirus /CpG+Alhydrogel與PBS對照組在整個試驗中沒有檢測到任何PPV特異性中和抗體。

3.11 生長抑素抗體ELISA檢測結(jié)果

間接ELISA檢測2免后2周血清生長抑素抗體水平。結(jié)果表明：免疫重組蛋白rSS4-VP2/Alhydrogel、rSS4-VP2/IMS、rSS4-VP2/CpG+IMS、rSS4-VP2/CpG+Alhydrogel、rBac-SS4-VP2均產(chǎn)生了特異性抗體，而對照組Wild Baculovirus/CpG+Alhydrogel與PBS組沒有特異性抗體產(chǎn)生。rSS4-VP2/Alhydrogel組抗體水平最高，稍高于其他組，其他重組蛋白免疫組間差異不顯著(圖11)。

3.12 生長激素濃度的檢測結(jié)果

免疫重組蛋白的各免疫組 GH濃度均有明顯升高，rSS4-VP2/Alhydrogel組GH水平最高，其他重組蛋白免疫組間差異不顯著，rSS4-VP2/Oil組稍微低一些，但與Wild Baculovirus /CpG+Alhydrogel和PBS對照組相比明顯升高(圖12)。

圖9 豬細小病毒試劑盒檢測抗體Fig.9 Antibody detected by the kit.Values with different letters indicate significant differences(P＜0.05).

圖10 免疫小鼠PPV特異性中和抗體Fig.10 PPV specific neutralizing antibody detection for the immunized mice.

圖11 各組小鼠血清生長抑素抗體水平Fig.11 Antibody level in serum of the immunized mice.Values with different letters indicate significant differences(P＜0.05).

圖12 免疫小鼠生長激素水平檢測Fig.12 GH level in serum of the immunized mice.Values with different letters indicate significant differences(P＜0.05).

4 討論

豬細小病毒是一種重要的豬繁殖障礙疾病，當(dāng)前應(yīng)用較多的是滅活疫苗，但其存在著許多缺陷和不足。豬細小病毒在 PK-15或 ST細胞上增殖的滴度較低，增加了滅活疫苗的生產(chǎn)成本，并且在生產(chǎn)滅活苗的過程中涉及到強毒的繁殖，因此存在散毒的潛在危險；滅活疫苗產(chǎn)生抗體慢，僅能誘發(fā)體液免疫應(yīng)答，不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生輕微的細胞免疫應(yīng)答和局部黏膜免疫應(yīng)答；滅活疫苗免疫保護時間短，需多次或反復(fù)接種，使用劑量大，費用較高；不能產(chǎn)生局部分泌型抗體SIgA，不能阻止病原微生物的局部感染；以及滅活疫苗免疫效果的不穩(wěn)定等。因此尋找和發(fā)展更為安全有效的疫苗一直是豬細小病毒病免疫預(yù)防研究的重要內(nèi)容。豬細小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP2可自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，VLPs不僅本身具有良好的免疫原性，而且可以用作載體對半抗原分子進行展示，以提高半抗原的免疫原性。王金良等[14]將VP2全基因進行原核表達，并利用所表達的蛋白建立了檢測PPV血清抗體的間接ELISA方法。魏戰(zhàn)勇等將PPVVP2基因克隆至pCI-neo真核表達載體中，構(gòu)建了 pCI-neo-VP2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至 PK-15細胞中，并以小鼠為動物模型，將pCI-neo-VP2、pCI-neo重組質(zhì)粒、PPV活疫苗和對照組通過肌肉注射進行免疫，結(jié)果顯示：pCI-neo-VP2在體外能夠誘導(dǎo) PK-15細胞表達 VP2蛋白，小鼠注射pCIneo-VP2質(zhì)粒1周后能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，4周時達到高峰，與活疫苗對照組產(chǎn)生的抗體滴度、誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖和誘導(dǎo)強的細胞毒性基本一致。

桿狀病毒表達系統(tǒng)具有與動物細胞相似的轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工等功能，表達的外源蛋白保持原有的生物學(xué)活性，迄今已成功地用于表達多種病毒抗原，有些病毒結(jié)構(gòu)蛋白可形成病毒樣粒子(Virus-like particles，VLPs)[15-16]。作為一種安全的抗原載體，越來越多的學(xué)者將多肽基因與在大腸桿菌、酵母、桿狀病毒等不同表達系統(tǒng)中能自我組裝成病毒樣顆粒的病毒衣殼蛋白基因融合[17-18]，以增強多肽的免疫原性。Martinez等[19]將PPVVP2基因克隆至桿狀病毒表達系統(tǒng)并在昆蟲細胞中高產(chǎn)量表達。表達產(chǎn)物可自我裝配成粒子，在結(jié)構(gòu)和抗原性上與常規(guī)的PPV衣殼并無差異。將高度提純的表達產(chǎn)物(類病毒粒子)免疫豬，其免疫效果與商品化的PPV疫苗的相同。Sedlik等[18]證明攜帶淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的CTL表位的PPV VP2自我裝配形成的假病毒粒子，免疫動物后，免疫動物能抵抗致死量病毒的攻擊。細小病毒的VP2基因可以獨立地或者形成雜合的類病毒粒子并引起宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答[20-21]，說明VP2蛋白產(chǎn)生的類病毒粒子具有良好的免疫原性，而且作為一種抗原的轉(zhuǎn)運載體具有很大的潛在價值，為進行多價重組疫苗的研究創(chuàng)造了良好的條件。

SS是動物生長調(diào)節(jié)的一個重要因子。研究表明，所有哺乳動物 SS的分子結(jié)構(gòu)均相同，無種屬特異性。豬免疫生長抑素后不影響豬肉品質(zhì)，人通過免疫后的豬肉攝入生長抑素或生長抑素的抗體，不會產(chǎn)生副作用，因為生長抑素本身在人體內(nèi)就是存在的，而生長抑素的抗體在豬肉加工的的過程中將會被破壞，失去活性。并且已有多種文獻報道，SS已廣泛用于治療各種人類疾病，具有較好的生物安全性能。

本實驗以豬細小病毒VP2蛋白可在桿狀病毒表達中自我組裝成病毒樣顆粒為基礎(chǔ)，在VP2基因5′端連接一小段基因不影響裝配的特性，將其作為小分子量外源蛋白的運輸載體。設(shè)計了以PPV的核衣殼蛋白VP2為支架載體，以四拷貝的生長抑素為展示蛋白，試圖制備出攜帶生長抑素的PPV病毒樣顆粒，這種展示生長抑素的設(shè)計尚屬首次。Western blotting、IFA證明了桿狀病毒表達的重組蛋白具有生物活性，可以與豬細小病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在感染重組病毒的Sf-9細胞內(nèi)含有直徑約為20～30 nm、形態(tài)大小均與全病毒粒子相似的病毒粒子，也證實了在體外細小病毒能與其他蛋白自我組裝成雜合的病毒樣顆粒。

為了檢測重組蛋白的免疫效力并篩選出能顯著增強重組蛋白免疫效力的佐劑，重組蛋白分別輔以鋁膠、IMS和白油不同佐劑免疫小鼠，通過豬細小病毒特異性抗體水平，PPV特異性中和抗體水平，生長抑素抗體水平的檢測，結(jié)果均檢測到了特異性抗體；生長激素水平的檢測，發(fā)現(xiàn)生長激素水平明顯提高，證實重組蛋白具有較好的免疫效力。其中鋁膠佐劑組抗體水平最高，因其可吸附抗原形成凝聚性大顆粒，易被細胞吞噬而增強抗原的免疫原性；白油佐劑組抗體水平最低，油乳苗產(chǎn)生免疫力慢，抗體空白期長；CpG效果不明顯，分析原因可能是CpG主要刺激機體產(chǎn)生細胞免疫；從而篩選出鋁膠佐劑是比較適合的佐劑。

本實驗得到的細小病毒抗體水平達到了較高的水平。生長抑素相關(guān)測定數(shù)值整體都稍低，這與免疫動物的日齡、免疫劑量、抗體水平測定時間有很大關(guān)系，因動物體內(nèi)存在SS，不同年齡存在量不同；SS免疫不同動物免疫反應(yīng)的強弱不同，同種類甚至同群動物中，抗體產(chǎn)生強度和速度也有明顯變化。另一方面由于市場上無法買到小鼠生長激素放射免疫分析檢測試劑盒，所以本實驗用的是人源的生長激素放射免疫分析檢測試劑盒，存在著種屬差異性，測定值會稍有影響，但對照組與實驗組橫向比較，數(shù)據(jù)都明顯升高。

總之，重組蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中形成的雜合病毒樣顆粒在小鼠免疫試驗中展現(xiàn)了良好的免疫效力，為進一步研究既可預(yù)防豬細小病毒病，也能提高豬生長速度的二聯(lián)疫苗奠定了基礎(chǔ)。目前正在進行重組蛋白豬體免疫效力試驗。

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Construction and immunogenicity of recombinant porcine parvovirus-like particles with somatostatin

Xuehua Zhang1,2, Qisheng Zheng1, Jin Chen1, Gang Xue1,2, Hongyan Hou1, and Jibo Hou1
1 National Research Center of Veterinary Biological Engineering and Technology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China 2 Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Received:December 23, 2009;Accepted:May 17, 2010

Supported by:Construction Projects of National Research Center of Veterinary Biologicals Engineering and Technology(No.4910706), Scientific Research on Public Causes of National Agriculture(No.200803020).

Corresponding author:Jibo Hou.Tel: +86-25-84392008; E-mail: houjibo@jaas.ac.cn國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心建設(shè)項目(No.4910706)，國家農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(No.200803020)資助。