王秀艷

（赤峰學院 生命科學系，內蒙古 赤峰 024000）

VB1對平菇天達300液體菌種菌絲體和胞外多糖含量的影響

王秀艷

（赤峰學院 生命科學系，內蒙古 赤峰 024000）

在平菇天達300液體培養(yǎng)基中加入VB1作為刺激因子,測量其對平菇天達300菌絲體干重和胞外多糖含量的影響.實驗表明,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的VB1對平菇天達300菌絲體含量無明顯影響；而加入不同濃度的VB1對胞外多糖含量的影響明顯，當濃度為0.75mg/L時，胞外多糖的含量達到最大值.

平菇天達300；VB1；胞外多糖；菌絲體干重

平菇隸屬于真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，無隔擔子菌亞綱，傘菌目，側耳科，側耳屬（Pleurotus）亦稱平菇屬.

平菇是一種木腐真菌，自然情況下生長在楊、榆、柳、槐等多種死亡的闊葉樹干上.平菇適應性廣，抗逆性強，凡含有木質素、纖維素、半纖維素的原料均可培養(yǎng)平菇，而且生產周期短，生物效率高，因此它是具有投資少、成本低、經濟效益高等優(yōu)點的一種栽培菌.

平菇的營養(yǎng)十分豐富，它的蛋白質含量高，占干重的30%~40%，并含有多種氨基酸，纖維素和礦物質，是人體所需要的維生素（硫胺素、核黃素、煙酸）和礦物質（磷、鐵、鉀、鈣）等的良好營養(yǎng)源.

平菇的代謝產物很豐富，有抗腫瘤的多糖蛋白，有抗菌作用的抗生素，有降低血壓、防治腦血管障礙的微量牛黃酸、有利于胃腸功能的菌多糖、甘露糖、維生素和幫助消化的各種酶，還有抗衰老、增強免疫功能的硒元素，因此多食平菇既可增加營養(yǎng)又可防治高血壓、心血管病、糖尿病、癌癥、中年肥胖癥等疾病.

VB1是多數真菌生長發(fā)育的必需因子，本文研究了不同濃度VB1對平菇天達300液體菌種菌絲體生長和胞外多糖含量的影響.

實驗流程：PDA培養(yǎng)基的制備—→母種的擴繁—→液體培養(yǎng)基的制備—→液體菌種接種—→搖床培養(yǎng)—→胞外多糖及菌絲體干重的測定.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種：平菇天達300（由江蘇省江都市天達食用菌研究所提供）.

1.1.2 儀器：滅菌鍋、烘干箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺 、水浴鍋、搖床、723分光光度計.

1.2 實驗濃度設置

實驗濃度設置見表1.

表1 實驗濃度設置

1.3 方法

1.3.1 母種培養(yǎng)基的制備、滅菌及檢測

母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g，瓊脂20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml

清洗1000ml燒杯2個、玻璃棒1根、試管20個、棉塞20個.選擇質量較好的馬鈴薯（無病、未出芽、不干縮）洗凈去皮，挖去芽眼，切成薄片稱取200克，加水1000ml.煮沸10~15分鐘，至酥而不爛的程度，用4~6層紗布過濾一次，取其濾液，加入瓊脂20克，用小火加熱至瓊脂全部溶解，如果濾液不足1000ml需加水補足，煮沸后加入葡萄糖20克，攪拌溶解，調解pH值（pH=6）將調好PH值的培養(yǎng)基趁熱及時分裝18mm×180mm或20mm×200mm的試管中.一般裝入量為試管總長度的1/4.分裝時，應盡量注意勿使培養(yǎng)基黏附在試管口壁上，如有黏附則用干紗布擦去，分裝的試管塞上棉塞，棉塞的作用是保證通氣性，防止雜菌污染.所以棉塞必須大小適當，松緊合適.棉塞在試管內外的比例為2：1.

塞好棉塞的試管每10支捆成一捆，上面用一層牛皮紙或二層報紙包扎好，以免滅菌時水蒸氣浸濕棉塞.然后豎直放入高壓鍋內滅菌30分鐘,滅菌壓力1.47×105Pa,溫度為121℃.

滅菌后，待滅菌鍋內的溫度降到60℃ 時取出試管制成斜面，斜面的長度以占試管的總長度的3/4為宜.

凝固后的斜面培養(yǎng)基，在使用前應進行無菌檢測，即從制備的斜面培養(yǎng)基中隨機抽取3~5支，置于30℃±1℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，如培養(yǎng)基表面光滑，無雜菌出現方可使用.

1.3.2 母種擴繁及培養(yǎng)

將所用器具：接種鏟、斜面試管、酒精燈,75%酒精棉球放入超凈工作臺進行紫外燈滅菌30分鐘.

將菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中，斜面向上，并使它們位于水平位置，也可將試管放在左手，用手掌托住試管.

先將棉塞用右手擰轉松動，以利于接種時拔出，右手拿接種鏟（在火焰上燒紅滅菌，在接種時可能進入試管的長柄部分也應灼燒滅菌）.

左手拿的試管要靠近火焰旁，用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞；用火焰灼燒管口（靠手腕動作）以殺死上面沾染的雜菌.

在火焰旁，將燒過的接種鏟水平伸入菌種管內，先接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌種.然后切取蠶豆大的一小塊菌塊，慢慢將菌種鏟抽出，注意不要使菌種碰到試管內壁，取出后不可使菌塊通過火焰，迅速將接種鏟在火焰旁伸進另一試管，將菌塊放在培養(yǎng)基中部，慢慢抽出接種鏟后，勿碰試管內壁，然后塞好棉塞，灼燒試管口和棉塞，重復上述操作.將接好的試管放在恒溫培養(yǎng)箱內25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)7天左右，待菌絲長滿斜面，選取菌絲生長健壯、潔白、濃密、均勻的優(yōu)質菌種進行使用或保藏，.在此期間應每天觀察一次，觀察是否有雜菌感染，如果有及時將試管取出，以免污染其它菌種.

1.3.3 液體培養(yǎng)基的制備

1.3.3.1 液體培養(yǎng)基配方

玉米粉 5%，MgSO40.15g，KH2PO40.15g，100ml蒸餾水

清洗錐形瓶12個、玻璃棒5根、1000毫升燒杯7個，烘干待用.制作12個棉塞要求兩層紗布中間加一層厚約0.5cm的棉花（要保證通氣性，防止雜菌侵染）.準確稱量玉米粉 5g,MgSO40.15g，KH2PO40.15g，蒸餾水 100ml.用電子秤精確量取VB10.05mg，定容至200ml，即所配制VB1母液濃度為0.25mg/L.

1.3.3.2 液體培養(yǎng)基的制備過程

取5個1000ml大燒杯，各放入玉米粉4份，每份5g然后各加蒸餾水500ml（含蒸發(fā)量），用玻璃棒攪拌，放在70℃恒溫水浴鍋內保溫1小時，并用玻璃棒不斷攪拌，1小時后取出燒杯靜置10分鐘，用8層紗布過濾，提取上清液.用100ml量筒量取上清液100ml放入事先準備好的、分別裝有MgSO40.15g，K.H2PO40.15g的錐形瓶內.然后向每個錐形瓶內加入玻璃珠15顆.

把12個錐形瓶分成2組，編號，分別標記VB1的濃度為：1號0mg/L,2號0.25mg/L,3號0.5mg/L,4號0.75mg/L,5號1.0mg/L,6號1.25mg/L.每個濃度各3瓶.用移液槍吸取0.25mg/l,0.5mg/l,0.75mg/l,1.0mg/l,1.25mg/l的 VB1放入對應的錐形瓶內.0mg/l的3瓶作為對照組.搖勻，用棉塞加二層報紙包裹用橡皮筋扎住，放在滅菌鍋內滅菌35分鐘（滅菌過程同上）.

1.3.4 液體菌種接種、搖床培養(yǎng)及斜面培養(yǎng)基的保藏

首先將接種工具及菌種置于超凈工作臺內，紫外線滅菌30分鐘.操作時首先點燃酒精燈，用酒精棉球擦拭雙手、所用器具和斜面菌種.把錐形瓶上的棉塞松動.拔掉試管棉塞，保持管口水平，灼燒試管口，同時灼燒接種鏟，兩者在酒精燈兩側的同一條水平線上，邊灼燒邊伸入試管內，離菌絲1cm處，將二者同時離開火焰，待接種鏟冷卻后，鏟出面積為1.5cm2的菌塊（盡量保持所有菌塊大小一致），用右手掀去錐形瓶棉塞將菌塊無菌接入液體培養(yǎng)基內，保持菌絲朝上，扎上棉塞，連續(xù)接種（注意斜面菌種所帶的培養(yǎng)基越薄越好）.取出錐形瓶，放入25±1℃恒溫培養(yǎng)箱內靜置24小時，記錄時間.

次日同一時間將液體菌種放入25±1℃，180r/min搖床上振蕩培養(yǎng)7天,在這期間要每天觀察1—2次,首先看是否有雜菌感染,其次是注意保持通風保證菌絲體有氧呼吸,最后觀察菌絲球的生長狀況,菌絲球分布均勻,菌液澄清，有菇香味為生長成熟.

將剩余斜面菌種放在4℃冰箱中保存.保存方法如下：把聚乙烯塑料薄膜剪成長20cm、寬4cm的條帶大火灼燒試管口及棉塞，用塑料長條包裹試管口和棉塞，最后用火焰燒塑料趁熱使其黏合在一起，放入4℃冰箱中保存待用.

1.3.5 菌絲體干重的測定

搖床培養(yǎng)7天左右菌絲球生長成熟，將其放入超凈工作臺內，紫外燈滅菌30分鐘,用6層紗布（有標號且事先稱好重量）過濾，將濾過的菌絲球連同紗布放入與紗布標號對應的培養(yǎng)皿中，在烘干箱內60℃烘干稱恒重.

1.3.6 胞外多糖的測定

1.3.6.1 胞外多糖的測定原理

采用苯酚—硫酸法，以葡萄糖為標準液.

苯酚—硫酸試劑可以與游離的寡糖或多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應，己糖在490nm有最大吸收值，吸收值與糖濃度呈線性關系.

1.3.6.2 標準曲線的繪制

準確稱取分析純葡萄糖0.1g，用去離子水定容到100ml的容量瓶中，其葡萄糖濃度為1mg/ml.準確稱取苯酚9g，加54ml去離子水，得濃度為15%的苯酚溶液.取9支試管，1支為空白對照管，另外選取8個濃度的葡萄糖溶液來做平行實驗，分別加入 1mg/ml葡萄糖溶液 0ul，160ul，180ul，200ul，220ul，240ul，260ul，280ul，300ul， 再 分 別 加 蒸 餾 水2.0ml，1.84ml，1.82ml，1.80ml，1.78ml，1.76ml，1.74ml，1.72ml，1.70ml，每管中再加入15%的苯酚1ml，振蕩，搖勻，再加入5ml濃硫酸，迅速振蕩搖勻.（具體的藥品添加量見表2）.置25oC水浴鍋中保溫20min，取出，于490nm波長下測定其光密度（見表3為所測結果）.以葡萄糖濃度作為橫坐標，以光密度作為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1）.

表2 繪制標準曲線所加藥品列表

表3 490nm處測定不同葡萄糖濃度吸光值結果

1.3.6.3 樣品多糖含量的測定

吸取樣品液0.05ml，按上述步驟操作，繪制曲線，以曲線計算其多糖含量（表4為樣品光吸收值的測定結果）.

根據標準曲線的繪圖得出所得曲線的方程表達式y(tǒng)=0.007x－0.241，r=0.969,x為葡萄糖濃度,y為光吸收值根據表4所得出的樣品光吸收值可以求出樣品中葡萄糖得率，如表5所示.

表4 樣品光吸收值的測定結果

表5 由標準曲線所得樣品中（0.05ml）葡萄糖得率

2 結果與分析

2.1 不同濃度VB1對平菇天達300菌絲體得率的影響根據表6繪制曲線（圖2）.

由圖2得出VB1對平菇天達300菌絲體得率的影響并不是太明顯，隨濃度的變化菌絲體得率無明顯的變化.

表6 平菇天達300菌絲體得率

2.2 不同濃度VB1對平菇天達300菌絲體胞外多糖濃度的影響

根據表5繪制圖3,由圖3可以看出VB1對胞外多糖的影響較大，曲線在VB1的濃度為0～0.75mg/L時曲線呈現上升趨勢,到0.75mg/L時胞外多糖含量達到最高，爾后隨VB1濃度的升高多糖含量不再上升，甚至有所下降.因此刺激平菇天達300胞外多糖得率最適的VB1濃度為0.75mg/L.

3 結論

3.1 在深層發(fā)酵中，平菇天達300在不添加任何生長因子時，菌絲體得率和胞外多糖的含量都比較低.

3.2 在培養(yǎng)基中加入不同濃度的VB1對平菇天達300菌絲體生長均有不同程度的影響.

3.3 當的VB1添加量為0.75mg/L時胞外多糖含量達到最大值，而對菌絲體得率無明顯影響.

3.4 刺激因子在VB10～0.75mg/L范圍內與平菇天達300胞外多糖含量呈正相關，即隨濃VB1度升高胞外多糖的含量增加.

3.5 刺激因子濃度高于VB10.75mg/L后與平菇天達300胞外多糖含量呈負相關，即隨VB1濃度升高胞外多糖含量降低.

由上述分析可知:在平菇天達300液體培養(yǎng)基中加入濃度為0.75mg/L的時對VB1菌絲體胞外多糖含量影響最明顯,此時胞外多糖含量達最大值,但對菌絲體干重得率影響并不是太明顯,曲線比較平緩.這些應用到具體的生產實踐中可以提高平菇天達300的質量,對天達300液體產品開發(fā)具有重要意義.

〔1〕王桂芹，王秀艷.食用菌栽培.內蒙古科學技術出版社，2001.

〔2〕黃清榮，姜華，董洪新，劉林德，賈莉.榆黃菇發(fā)酵菌絲體及胞外多糖的影響因子的研究.安徽農業(yè)科學，2006，34（22）：5792—5793.

〔3〕寧慧清.苯酚硫酸法測定靈芝多糖的研究[J].太原師范學院學報（自然科學版），2006（3）：105—107.

〔4〕張桂春，辛小林，李紹龍.榆黃菇發(fā)酵全液多糖提取工藝的優(yōu)化[J].食用菌，2005（4）：62-64.

〔5〕盧青達，馬啟明.食用菌[M].濟南：山東科技出版社，1986.

〔6〕貢濟宇.苯酚硫酸法測定靈芝多糖含量的研究[J].長春中醫(yī)學院學報，1997（2）：82-86.

〔7〕張桂春，辛小林，王淑芳，等.金頂側耳胞外多糖測定方法和提純工藝的研究[J].工藝技術，2005（9）：134-136.

〔8〕王謙，張俊剛，郝利民，等.黃傘深層液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2004（25）：498-499.

〔9〕林耀輝.靈芝GL8801液體發(fā)酵胞外多糖的提取和結構研究[M].福州大學學報，1997(2)：82-86.

〔10〕 Solomko EF.Eliseera GS,Biosynthesis of Bvitamins by the hroom Pluertus sdtreatrs in the submerged culture:Peikl Biohim Mikroviol.1998,24(2),164.

Q949.32

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1673-260X（2010）02-0015-04