胡永飛,李鐵民,張 博,楊志勇,李 玉

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院,遼寧沈陽 110036)

抗噬菌體重組鈍齒棒桿菌的生理穩(wěn)定性

胡永飛,李鐵民＊,張 博,楊志勇,李 玉

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院,遼寧沈陽 110036)

為了探索抗噬菌體重組鈍齒棒桿菌的應(yīng)用可行性,對(duì)重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的穩(wěn)定性以及其對(duì)宿主細(xì)胞生長代謝的影響進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組質(zhì)粒在鈍齒棒桿菌中具有較好的穩(wěn)定性,它在鈍齒棒桿菌中的存在對(duì)重組菌株的早期生長有些影響,但未影響重組菌株的谷氨酸產(chǎn)生量。

鈍齒棒桿菌;重組質(zhì)粒;質(zhì)粒穩(wěn)定性;生長速率;谷氨酸

鈍齒棒桿菌是產(chǎn)生谷氨酸的菌株之一,其不同衍生株在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。然而,由于發(fā)酵生產(chǎn)的規(guī)模化和連續(xù)性,生產(chǎn)中的菌種極易感染噬菌體,所以噬菌體污染一直是影響谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。雖然通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝,改善衛(wèi)生條件,控制生產(chǎn)環(huán)節(jié),噬菌體污染現(xiàn)象有所減輕,但仍時(shí)常發(fā)生[1-2]。為了解決谷氨酸發(fā)酵中的噬菌體污染問題,利用質(zhì)粒攜帶的cglⅠ基因復(fù)合體構(gòu)建了抗噬菌體鈍齒棒桿菌基因工程菌,證實(shí)了cglⅠ基因復(fù)合體在鈍齒棒桿菌中的抗噬菌體功能活性[3]。由于構(gòu)建抗噬菌體基因工程菌的策略采用的是質(zhì)粒表達(dá)外源基因,而且表達(dá)的外源基因是限制修飾(RM)系統(tǒng)基因復(fù)合體,所以重組質(zhì)粒以及其所攜帶的RM在鈍齒棒桿菌中的行為如何尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為此,本文對(duì)重組質(zhì)粒在鈍齒棒桿菌中的穩(wěn)定性以及其對(duì)宿主細(xì)胞生長代謝的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鈍齒棒桿菌T6-13(野生型)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,含有質(zhì)粒pJL23-cglⅠ的重組鈍齒棒桿菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[3]。

1.1.2 噬菌體 5株噬菌體AS-I V3C44～ASI V3C48購自武漢病毒研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 鈍齒棒桿菌T6-13(野生型)和重組鈍齒棒桿菌培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(固體或液體),需要時(shí)添加50μL/mL卡那霉素。

1.2.2 噬菌體裂解液的制備 具體方法參見文獻(xiàn)[4]。

1.2.3 噬菌體效價(jià)測定 具體方法參見文獻(xiàn)[4]。噬菌體效價(jià)(pfu/mL)=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.2.4 噬菌體抗性檢測 采用平板空斑法,成斑率(Efficiency of plaquing,EOP)計(jì)算方法見下式[5],敏感菌株的EOP等于1。

1.2.5 菌株傳代[6]在LB/Km-平板上劃線接種重組鈍齒棒桿菌,30℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落,連續(xù)劃線接種傳代100次。將傳代次數(shù)為1、10、20、30、……80、90、100的平板4℃保存。

1.2.6 質(zhì)粒分離穩(wěn)定性測定[6]從不同傳代次數(shù)(1、10、20、30、……80、90、100)的LB/Km-平板上,用無菌牙簽分別挑取100個(gè)單菌落,分別在LB/Km-和LB/Km+平板對(duì)應(yīng)位置上劃短線,30℃過夜培養(yǎng)。計(jì)數(shù)不同代次重組菌株在LB/Km-和LB/Km+平板上的生長數(shù),計(jì)算重組菌株在無Km選擇壓力條件下質(zhì)粒的丟失率。質(zhì)粒穩(wěn)定性(%)=(LB/Km+平板上的生長數(shù))/(LB/Km-平板上的生長數(shù))×100%。

1.2.7 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性測定[6]從不同傳代次數(shù)(原代、20、40、60、80、100)的LB/Km-平板上,用無菌牙簽分別挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,30℃過夜培養(yǎng)后,采用噬菌體抗性實(shí)驗(yàn)檢測重組菌株質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

1.2.8 生長曲線測定[7]以野生菌株作對(duì)照,測定重組菌株的生長曲線,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.9 谷氨酸測定[7]重組菌株與野生菌株(對(duì)照)分別搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h,從20 h起開始取樣,每隔4 h取樣1次,取樣時(shí)間分別設(shè)為20、24、28、32、36、40、44、48 h。采用大腸埃希菌L-谷氨酸脫羧酶解法使谷氨酸分解成CO2氣體,用微量呼吸檢壓儀定量測定產(chǎn)生的CO2量,根據(jù)反應(yīng)方程式計(jì)算出谷氨酸含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的分離穩(wěn)定性

重組鈍齒棒桿菌在無卡那霉素抗性選擇壓力的條件下,在LB固體平板上連續(xù)傳代100次,每隔10代次檢測1次質(zhì)粒丟失情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在重組鈍齒棒桿菌中未見明顯丟失現(xiàn)象(見表1)。

表1 重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的分離穩(wěn)定性Table 1 Segregation stability of recombinant plas mid pJL23-cglⅠinC.crenatum

2.2 重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

表2 重組鈍齒棒桿菌在不同傳代次數(shù)中的噬菌體抗性(EOP)Table 2 Resistance of recombinant C.crenatum in times of culture transferred against phages

取傳代次數(shù)分別為原代、20、40、60、80、100次的重組鈍齒棒桿菌進(jìn)行噬菌體抗性定量檢測,通過噬菌體感染實(shí)驗(yàn)分析cglⅠ基因在傳代過程中是否正常表達(dá),以此考察重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。由表2可以看出,重組鈍齒棒桿菌在傳代過程中一直保持抗噬菌體活性,與原代菌株相比,EOP均小于10-8。表明cglⅠ基因在重組鈍齒棒桿菌株中穩(wěn)定表達(dá),即在傳代培養(yǎng)過程中,重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

2.3 重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ對(duì)鈍齒棒桿菌生長的影響

從野生鈍齒棒桿菌和重組鈍齒棒桿菌的生長曲線可以看出(見圖1),在相同培養(yǎng)條件下,野生鈍齒棒桿菌培養(yǎng)到3 h左右便達(dá)到對(duì)數(shù)生長期,而重組鈍齒棒桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)期的時(shí)間約延遲1 h左右,但二者達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間趨于相同?？傮w上2個(gè)菌株的生長率相差不大,只是重組鈍齒棒桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長速度要略晚于野生鈍齒棒桿菌。

圖1 野生鈍齒棒桿菌和重組鈍齒棒桿菌的生長曲線Fig.1 The growth curves of wild C.crenatum and recombinant C.crenatum

2.4 重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ對(duì)鈍齒棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸的影響

由圖2可以看出,重組鈍齒棒桿菌和野生鈍齒棒桿菌在發(fā)酵過程中谷氨酸積累量的變化趨勢基本一致,具有相同的谷氨酸積累高峰,即在發(fā)酵32 h有最大的谷氨酸積累量,分別為277.74 mg/ L和261.39 mg/L,表明重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ的導(dǎo)入并未影響鈍齒棒桿菌的代謝產(chǎn)酸量。

圖2 谷氨酸產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Dynamics curves of glutamate production

3 討 論

對(duì)重組鈍齒棒桿菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明,重組菌株連續(xù)傳100代次后,沒有發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象,且仍具有原代菌株的功能活性,表明重組菌株中的質(zhì)粒具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和分離穩(wěn)定性,推測重組質(zhì)粒穩(wěn)定性可能與質(zhì)粒上攜帶的RM系統(tǒng)cglⅠ基因復(fù)合體有關(guān)。報(bào)道表明,一些Ⅱ型RM基因系統(tǒng)具有分離后殺死活性,可以介導(dǎo)維持質(zhì)粒穩(wěn)定性[8-11]。正常情況下,細(xì)胞中的M酶保護(hù)宿主染色體免遭R酶的致死性裂解。然而,一旦RM基因系統(tǒng)從細(xì)胞中被根除,隨著細(xì)胞分裂,由于稀釋,子代細(xì)胞中含有的M酶將越來越少,結(jié)果是M酶保護(hù)新復(fù)制的染色體上的許多識(shí)別位點(diǎn)的能力漸漸減弱。這樣,染色體DNA上未被甲基化的位點(diǎn)將受到攻擊,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同樣,RM基因系統(tǒng)丟失后,隨著細(xì)胞分裂,R酶也將被稀釋。然而,M酶和R酶在作用方式上存在不平衡,也就是說,R酶殺死細(xì)胞時(shí),只需染色體上一處斷裂就可以充分有效(除非DNA被修復(fù)),而對(duì)于M酶而言,對(duì)宿主的保護(hù),則需要染色體上上百個(gè)識(shí)別位點(diǎn)被甲基化[12]。雖然推測重組菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性與質(zhì)粒上攜帶的RM基因復(fù)合體有關(guān),但其確切原因和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

cglⅠ基因復(fù)合體在鈍齒棒桿菌中表達(dá)后,首先通過甲基轉(zhuǎn)移酶在特異識(shí)別序列上使宿主基因組DNA胞嘧啶甲基化,以避免相應(yīng)限制酶的裂解。這樣,宿主基因組DNA胞嘧啶被甲基化后,是否對(duì)重組棒桿菌的生長代謝產(chǎn)生影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組菌株達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)間略晚于野生菌株,表明重組菌株對(duì)數(shù)期生長有些緩慢,但進(jìn)入穩(wěn)定期后兩者趨于一致。分析原因可能有以下幾方面:①重組質(zhì)粒在宿主菌中復(fù)制、外源基因產(chǎn)物的表達(dá)增加了細(xì)菌細(xì)胞的代謝壓力;②含有質(zhì)粒的重組菌株需要更多的能量和營養(yǎng)合成更多的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì);③質(zhì)粒的復(fù)制和表達(dá)也將與宿主細(xì)胞競爭可用的原料物質(zhì),從而影響細(xì)菌的生長速率[13-14]。

重組鈍齒棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸的研究結(jié)果表明,重組菌株和野生菌株在實(shí)驗(yàn)發(fā)酵過程中谷氨酸積累量的變化基本趨于一致,表明重組質(zhì)粒的導(dǎo)入并未影響菌株的代謝產(chǎn)酸量。

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Physiological Stability of the Recombinant Corynebacterium cretanum with Phage Resistance

HU Yong-fei,L I Tie-min,ZHANG Bo,YANG Zhi-yong,LI Yu
(Sch.of Life Sci.,Liaoning Uni.,Shenyang110036)

In order to explore the feasibility to apply to an engineered phage-resistant Corynebacterium cretanum strain,a recombinant plasmid pJL23-cglI in C.crenatum and the effect of it on the growth metabolism of host cells was studied.The results showed that the recombinant plasmid pJL23-cglI stably maintained inC.crenatum,and the recombinant plas mid pJL23-cglI had some impact on the early growth of the recombinant C.crenatum,but no effect was found on its production of glutamate.

Corynebacterium cretanum;recombinant plas mid;plasmid stability;growth rate;glutamate

Q78

A

1005-7021(2010)06-0051-04

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金(20082501);沈陽市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(1091187-1-00)

胡永飛 男,博士。研究方向?yàn)槲⑸锷锕こ獭?/p>

＊通訊作者。Tel:024-62202232,E-mail:tieminli@lnu.edu.cn

2010-08-25;

2010-11-01