馬曉穎,高 穎,賈東貝,李冰宇,叢 玲,王 娜,楊 濤＊

(1.沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境工程學院,遼寧沈陽 110161;2.遼寧省農業(yè)科學院生命科學中心,遼寧沈陽 110161)

1株Alternariasp.真菌菌絲提取物對玉米種子發(fā)芽促進作用的研究

馬曉穎1,高 穎1,賈東貝1,李冰宇1,叢 玲2,王 娜2,楊 濤2＊

(1.沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境工程學院,遼寧沈陽 110161;2.遼寧省農業(yè)科學院生命科學中心,遼寧沈陽 110161)

從健康的野生山棗根部分離得到1株真菌,經分子鑒定其為支鏈孢屬A lternariasp.并且對其進行液體培養(yǎng)到生長期后,菌絲體用4層紗布濾出,40℃烘干,研磨后用乙醇浸提3次,合并濾液,并測定其菌絲醇提取物的濃度,配成1、10、100μg/mL的濃度,進行玉米種子催芽試驗。結果表明,濃度為1、10μg/mL的醇提取物,均可提高玉米種子的發(fā)芽指數(shù),而濃度為100μg/mL的醇提取物則會降低玉米種子發(fā)芽指數(shù)。

真菌;提取物;玉米;發(fā)芽指數(shù)

真菌的次生代謝產物種類十分豐富,基本涵蓋了所有化合物類型,包括生物堿、黃酮類化合物、芳香類化合物、揮發(fā)性物質、皂普、酚類、多炔類、異香豆素類等。在對次生代謝產物的分離純化的研究中,分離得到各種類型的化合物。鏈格孢(Alternaria)是自然生態(tài)系統(tǒng)和農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員,在自然界物質循環(huán)中起著一定作用。已有研究指出:在分離出來的數(shù)十種鏈格孢菌次生代謝產物中,除真菌毒素外,也有殺蟲、殺菌和殺原生生物的活性物質存在[1]。有研究表明,從部分鏈格孢次級代謝產物中提取的蛋白能誘導植物產生系統(tǒng)抗性,促進植物生長,改善作物品質,可發(fā)展為新型的多功能生物農藥[2]。如分離自1株菊池鏈格孢真菌的植物生長刺激素3,6-二羥基蜂蜜曲菌素,具有促進水稻秧苗根莖生長作用。本文從野生山棗根部分離出一種Alternaria sp.真菌,并用其醇提取物進行玉米種子的催芽效果試驗,為微生物(鏈格孢)在多功能農藥資源的開發(fā)提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離

將根系自土塊中取出,輕輕抖動除去松散附在根上的土粒,稱取10 g根系,置于盛100 mL無菌水的三角瓶中,振蕩15 min,以洗下的土制成土壤浸提液。吸取各種植物的根際土壤浸提液制成不同濃度梯度的土壤濃度懸浮液,吸取10-3～10-5土壤濃度懸浮液0.1 mL(約2滴),加到孟加拉紅分離培養(yǎng)基和PDA平板上,用滅菌涂布棒涂均勻,28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～7 d。

1.2 菌株的發(fā)酵

將分離得到的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上, 25℃培養(yǎng)5～7 d,用6 mm打孔器打孔,取3片接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)液(PDA培養(yǎng)基)的250 mL三角瓶,于28℃,140 r/min的旋轉搖床上培養(yǎng)3 d作為種子液。將上述種子液以10%接種量接入裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(同種子培養(yǎng)液)的500 mL三角瓶中,同樣條件下培養(yǎng)5 d,終止發(fā)酵,放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌絲醇提取物的制備

將培養(yǎng)好的菌絲體洗滌后60℃下烘干,稱重,然后用高速粉碎機粉碎,加入同體積乙醇用磁力攪拌器將其混勻攪拌24 h,浸提3次,真空抽濾,收集濾液備用。

1.4 催芽試驗

將上述野生山棗菌菌絲醇提取物配成1、10、100μg/mL不同濃度對玉米種子進行催芽試驗。將種子放在配好的不同濃度的醇提取物中,在28℃水浴1 h,然后在無菌的培養(yǎng)皿中放雙層濾紙,每皿放7粒,加20 mL蒸餾水,每個濃度做2個重復,培養(yǎng)5 d。記錄并計算出其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指標。

發(fā)芽指數(shù)=∑(在t日的發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù))

活力指數(shù)=芽長×發(fā)芽指數(shù)

1.5 分子鑒定

利用CTAB法對篩選的真菌進行基因組DNA的提取,并且用1對通用引物ITS4與ITS5進行基因的擴增和測序。ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應體系為50μL,PCR buffering(Mg2+)加1/10,dNTPs各200μmoL/L,引物各0.2μmol/L,TaqDNA聚合酶1～2.5 U,模板100 ng,無菌雙蒸水補足。反應條件為94℃預變性10 min,94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸2 min,共35個循環(huán),72℃延伸10 min,保存產物檢測使用的瓊脂糖凝膠,電泳在凝膠成像系統(tǒng)進行電泳結果觀察,濃度由上海生工生物工程有限公司純化并測序?；贐last搜索,選取與研究菌株序列最接近的種或最靠近的進化分支代表菌株的序列進行比對,利用DNAstar軟件建立進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)

在野生山棗根部篩出1株真菌S1(如圖1左所示)。等徑生長,初為白色,后漸變?yōu)榍嗪稚涟岛稚?邊緣整齊,呈波狀或裂片狀,在培養(yǎng)基表面可以看到有黑色的孢子堆形成。成熟的分生孢子具4～8個橫膈膜,1～5個縱隔膜,倒棍棒形,卵形或橢圓形,幼時孢子為透明無色,成熟后呈黑褐色(如圖1右所示)。

2.2 催芽試驗

將上述野生山棗菌菌絲醇提取物配制成不同的濃度,對玉米進行催芽試驗測試,野生山棗菌菌絲醇提取物對玉米種子萌發(fā)階段的促進作用(如表1所示),濃度為1、10μg/mL的醇提取物,均可提高玉米種子的發(fā)芽指數(shù),而濃度為100μg/ mL的醇提取物則會降低玉米種子發(fā)芽指數(shù)。

表1 不同濃度的提取物對玉米發(fā)芽的影響Table 1 The effect of different concentrations of extracts on the corn of germination

2.3 分子鑒定結果

圖2(左)為從S1真菌中擴增DNA序列圖。從圖2(左)中可以看出引物ITS5和ITS4成功地擴增出S1菌株ITS區(qū)段,得到了特異性單一片段,而在對照中未擴增出任何片段,表明整個反應沒有外來污染。該真菌基因組片段大小約為500 bp左右,且重現(xiàn)性較好。基于Blast搜索,選取與研究菌株序列最接近的種或最靠近的進化分支代表菌株的序列進行比對,利用DNAstar軟件建立進化樹(圖2右)。結果表明S1真菌與Alternaria sp.的同源相似性達到99%。

圖1 真菌S1的菌落形態(tài)(左),真菌S1的孢子形態(tài)(右)Fig.1 (Left)The colony of fungi S1,(right)The conidia of fungi S1

圖2 S1真菌擴增DNA序列圖(左),真菌S1通過ITS序列分析建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(右)Fig.2 Electrophoresis of amplifieation Produet fungi S1(left),Phylogenetic treesobtained from ITS sequencing analysis of fungi S1(right)

3 討 論

提取溶劑的篩選:菌株菌絲體一般都采用有機溶劑進行提取,根據(jù)極性的不同,將菌絲體顆粒分別用正丁醇、乙酸乙酯、乙醇進行提取,采用每種溶劑浸提3次,將3種提取物揮干溶劑后再用乙醇溶解,分別進行提取物的催芽試驗。結果如圖3所示,乙醇溶解部分的活性成分催芽效果明顯,這表明催芽的有效成分應該是極性較高的物質。

有效成分的確定:在本次試驗中,利用真菌S1的醇提取物進行玉米種子的催芽,并產生了顯著的效果,其作用機理和方式還未可知,其各個成分是聯(lián)合作用還是某一單獨的成分在起作用有待以后繼續(xù)深入的研究。

圖3 不同溶劑提取物對玉米發(fā)芽的影響Fig.3 The effect of different solvents of extracts on the corn of germination

[1]Montemurro N.,Visconti A.Alternaria metabolites-chemical and biological data[C].Chelkowski J,Visconti A.Alternaria: Biology,plant diseases and metabolites Amsterdam,Elsevier Science Publishers B.V.PartⅡ,1992:449-558.

[2]德文.植物用多功能真菌蛋白質[P].中國專利: ZL01128666,200423217.

[3]趙明治,楊秀芬,張明,等.一種促進植物根系生長的極細鏈格孢菌蛋白質分離、純化和生物功能[J].中國生物防治, 2008,23(2):170-173.

[4]印泉,孫奎,馬養(yǎng)民,等.無花果內生真菌的分離及其鑒定[J].西北植物學報,2004,24(7):1281-1285.

[5]Rim S.O.,J.H.Lee,S.A.Khan,et al.Isolation and identification of fungal strains producing gibberellins from the root of plants[J]. Microbiol.Biotechnol,2007,35:357-363.

[6]陸雅海,張福鎖.根際微生物的研究進展[J].土壤,2006,38 (2):113-121.

[7]趙斌,何紹江.微生物學實驗[M].北京:科學出版社,2002.

[8]陳國民,肖靜,李友國,等.從植物根際分離的8株細菌的促生作用與初步鑒定[J].湖北農業(yè)科學,2008,(1):39-41.

[9]沈平.微生物學[M].北京:高等教育出版社,2000:293-294.

[10]Toshikatsu Okuno,Ikuya Natsume,Ko Sawai T,et al.Structure of antifungal and phytotoxic pigments produced by Alternaria sp.[J].Tetrahedron Lett.,1983,24:53-56.

[11]Krohn K,Florke U,John M,et al.Biologically active metabolites from fungi.Part 16:New preussomerins J,K and L from an endophytic fungus[J].Tetrahedron,2001,57(20):4343-4348.

[12]馬天有,董兆麟.從植物分離產紫杉醇的內生真菌的研究[J].西北大學學報(自然科學版),1999,29(1):47-49.

Effect of Alternariasp.Mycelium Extracts on Maize Seed Germination

MA Xiao-ying1,GAO Ying1,JIA Dong-bei1,LI Bing-yu1,CONG Ling2,WANG Na2,YANG Tao2
(1.Shenyang Agric.Uni.Land&Environ.Engin.,Shenyang110161;2.Liaoning Acad.of Agric.Sci.Ctr.of Life Sci.,Shenyang110161)

A fungal strain was isolated from healthy roots of wild hill date.And the result of molecular identification showed this fungus was Alternaria sp.Fermentation in liquid medium was done using this fungus to study the effect of products.Its mycelium was filtered with four layers of gauze after its growth.Then the mycelium was dried at 40℃and ground into powder and extracted with ethanol three times and put all filtrates together.The extract concentration was deter mined.Different concentrations of this extraction(1μg/mL,10μg/mL,and 100μg/mL)were used to study the effect on maize seed germination.The test of seed germination indicated that the germination index was improved under the concentration of 1μg/mL and 10μg/mL while the germination index was decreased under the concentration of 100μg/mL.

fungus,extract,maize,germination index

Q939.9;S154.3

A

1005-7021(2010)06-0039-04

遼寧省科技攻關項目(2009208001)

馬曉穎 女,碩士研究生?，F(xiàn)從事微生物肥料相關研究。E-mail:mxy851001@126.com

＊通訊作者。E-mail:smkxzx@sina.com

2010-11-06;

2010-11-20