陶玉倩, 田 青, 葉文華, 楊 穎, 張 賽

神經(jīng)元的壞死、凋亡存在于很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程中,既往研究表明[1],在神經(jīng)元凋亡的典型形態(tài)學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)之前,?？捎^察到軸突損傷,軸突損傷對(duì)于整個(gè)神經(jīng)元死亡來(lái)說(shuō)可能是一個(gè)早期引發(fā)因素[2],然而在神經(jīng)元死亡早期,有關(guān)軸突網(wǎng)絡(luò)的退縮、崩解的分子生物化學(xué)機(jī)制還不清楚。Sema3A是分子量為 100kD的一種分泌型蛋白,由Luo等[3]首次從雞腦中提取。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中,Sema3A作為一種抑制性軸突導(dǎo)向因子,通過(guò)誘發(fā)軸突末端生長(zhǎng)錐崩解[3]來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)軸突生長(zhǎng)的定向?qū)Ш阶饔?。近年?lái)研究表明,成年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中也有 Sema3A的表達(dá),尤其在神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷后,例如脊髓創(chuàng)傷[4]、腦梗死[5]等,Sema3A與軸突再生的局限性有關(guān)[6]。而 Sema3A是否對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)具有阻滯作用,還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬以體外培養(yǎng)的 SD大鼠神經(jīng)元為細(xì)胞模型,觀察外源性 Sema3A對(duì)于神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的影響,進(jìn)而探討 Sema3A在神經(jīng)元死亡早期所起到的初始引發(fā)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 重組人 Sema3A/Fc融合蛋白購(gòu)自 R＆D System公司,溶于0.01mol/LPBS后,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ让?、DNA酶、胰酶抑制劑、阿糖胞苷、L-多聚賴氨酸、Hoechst33342染液、MTT等均購(gòu)自 Sigma公司。小鼠抗大鼠 MAP-2抗體購(gòu)自 Programma公司;FITC偶聯(lián)羊抗小鼠熒光二抗購(gòu)自 Jackson公司。Neurobasal培養(yǎng)基、B27均購(gòu)自 Invitrogen公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraus公司)、熒光顯微鏡(Olympus公司)、酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司)等實(shí)驗(yàn)儀器均由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 神經(jīng)元原代培養(yǎng) 新生 24h內(nèi)的 SD大鼠,由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。解剖顯微鏡下,用顯微手術(shù)鑷無(wú)菌剝?nèi)〈竽X皮層,并剔除腦膜及血管組織,D-Hanks液沖洗后剪碎(以上操作均在冰上進(jìn)行)。胰酶 (0.25mg/m l)消化,37℃,15min;離心 800rpm,1min,棄上清。加入 D-Hanks液(含 0.08mg/ml DNA酶及 0.56mg/ml胰酶抑制劑),終止消化,并吹散成懸液;靜置 15min后,取上清;離心 1500rpm,5min,棄上清。Neurobasal培養(yǎng)液(含 1%胎牛血清、2%B27)重懸細(xì)胞,吹散為單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整為合適的細(xì)胞密度,接種于 L-多聚賴氨酸(0.1mg/m l)預(yù)包被的培養(yǎng)皿中,置于 37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種 24h后加入阿糖胞苷(10μmol)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng),接種 3d后半量換液,以后每 3～4d半量換液一次。

1.3 神經(jīng)元生長(zhǎng)錐觀察 原代神經(jīng)元接種于六孔培養(yǎng)板,培養(yǎng) 24h后,進(jìn)行 Sema3A(終濃度為0.5 mg/m l)處理,24h后置于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4 MAP-2、Hoechst33342免疫熒光染色 原代神經(jīng)元接種于放有滅菌蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中,制成細(xì)胞爬片。培養(yǎng) 3d后,進(jìn)行 Sema3A處理。48h后,吸棄培養(yǎng)液,PBS漂洗 3次;4%多聚甲醛冰上固定 30min,PBS漂洗 3次;0.1%TritonX-100/PBS 37℃破膜 30min,PBS漂洗 3次;正常山羊血清室溫封閉 30min后棄血清免洗,加入小鼠抗大鼠MAP-2一抗(1∶200,1%BSA/PBS稀釋),濕盒內(nèi)孵育 4℃過(guò)夜。次日吸棄一抗,PBS漂洗 3次;滴加FITC偶聯(lián)的羊抗小鼠熒光二抗(1∶100,1%BSA/PBS稀釋)避光室溫孵育 1h,PBS漂洗后再滴加 Hoechst33342染液,染色 10m in;PBS充分漂洗后中性甘油封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 軸突長(zhǎng)度測(cè)量 神經(jīng)元貼壁培養(yǎng) 3d后,加入終濃度為 5mg/m l的 Sema3A,連續(xù)作用48h后,MAP-2免疫熒光染色,并拍攝顯微鏡下熒光圖像,利用 Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,以軸突末端至其胞體結(jié)合部的循跡距離為尺度界定標(biāo)準(zhǔn),測(cè)量圖像中所有細(xì)胞的軸突長(zhǎng)度。正常對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒光染色,并拍照測(cè)量軸突長(zhǎng)度。兩組分別隨機(jī)選取 10個(gè)視野,共有 250個(gè)神經(jīng)元的軸突納入測(cè)量。

1.6 MTT法測(cè)細(xì)胞活力 原代培養(yǎng)神經(jīng)元,調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×104個(gè)/L,種植于 96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng) 3d后,棄除原培養(yǎng)液,加入各種工作液。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(工作液為正常培養(yǎng)液)、Sema3A處理組(工作液為含不同濃度 Sema3A的細(xì)胞培養(yǎng)液,其中 Sema3A終濃度分別為 0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mg/ml),每組設(shè)立 6個(gè)平行復(fù)孔及 1個(gè)空白對(duì)照孔。各組工作液作用 48h后,進(jìn)行 MTT檢測(cè)：每孔加入 MTT 20μl(終濃度為 5mg/ml,避光),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 4h后,小心棄除上清,加入DMSO100μl,振蕩 10min溶解紫色結(jié)晶物,用酶標(biāo)儀檢測(cè) 490nm波長(zhǎng)處吸光度值(A490nm,OD)。兩組數(shù)據(jù)均扣除空白對(duì)照孔 A490nm值后,計(jì)算細(xì)胞存活率 Survival(%)=Sema3A處理組 A490nm值/正常對(duì)照組 A490nm值 ×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組獨(dú)立樣本均數(shù)間比較采用 t檢驗(yàn),多組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni法,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3次。

2 結(jié) 果

2.1 Sema3A引起神經(jīng)元生長(zhǎng)錐崩解 倒置相差顯微鏡下觀察,神經(jīng)元貼壁培養(yǎng) 24h后,軸突開始由胞體發(fā)出并向外延伸。正常對(duì)照組神經(jīng)元軸突末端呈扇形膨大,細(xì)小絲狀分支由扇形膨大處發(fā)出并向外伸展,為正常生長(zhǎng)錐形態(tài)(見圖1A);而加入外源性 Sema3A的神經(jīng)元軸突末端尖銳,扇形膨大結(jié)構(gòu)消失,生長(zhǎng)錐崩解(見圖1B)。

2.2 Sema3A抑制神經(jīng)元軸突生長(zhǎng) 熒光顯微鏡下觀察并測(cè)量神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度。神經(jīng)元貼壁培養(yǎng)5～6d后,觀察可見對(duì)照組 MAP-2免疫陽(yáng)性細(xì)胞的軸突較為粗壯、健康并且細(xì)胞之間軸突聯(lián)系密切(見圖2A);而 Sema3A處理組的神經(jīng)元軸突較為纖細(xì),部分細(xì)胞發(fā)生軸突退化與崩解(見圖2B)。經(jīng)測(cè)量對(duì)照組神經(jīng)元軸突平均長(zhǎng)度為(289.24±47.84)μm,而 Sema3A處理組的軸突平均長(zhǎng)度顯著縮短為(95.56±25.26)μm,兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,見圖3)。表明 Sema3A對(duì)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

2.3 Sema3A的神經(jīng)元毒性作用 MTT法檢測(cè)不同 Sema3A劑量組的神經(jīng)元活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Sema3A 0.5mg/m l開始對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用,細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組比較,降至 84.45±0.94(%);Sema3A的 IC50約為 2.5mg/ml;隨著 Sema3A劑量梯度增加,細(xì)胞存活率逐漸下降(見表1)。

表1 Sema3A對(duì)神經(jīng)元生存率的影響(±s,n=6)

表1 Sema3A對(duì)神經(jīng)元生存率的影響(±s,n=6)

與正常對(duì)照組比較*P＜0.001,△P＞0.05

組別 A 490nm 生存率 (%)正常對(duì)照組Sema3A 0.1(mg/ml)Sema3A 0.5(mg/ml)Sema3A 1.0(mg/ml)Sema3A 2.5(mg/ml)Sema3A 5.0(mg/ml)0.53±0.03 0.53±0.03△0.45±0.03*0.38±0.01*0.24±0.02*0.23±0.02*100.00±0.00 98.64±6.31△84.45±0.94*70.78±1.64*45.11±2.35*43.44±2.29*

圖1 倒置相差顯微鏡普光下生長(zhǎng)錐觀察 (×200)

圖2 MAP-2、Hoechst33342免疫熒光染色 (×200)

圖3 神經(jīng)元平均軸突長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果(±s,n=6)

3 討 論

在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中,神經(jīng)元的軸突沿著特定的路徑不斷延伸,直至到達(dá)將與其建立突觸聯(lián)系的靶點(diǎn)(靶細(xì)胞的胞體、樹突或軸突),最終形成精密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。而這一過(guò)程的精確調(diào)節(jié),需要軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子[7]的介導(dǎo)。在體內(nèi),Sema3A作為一種抑制性軸突導(dǎo)向因子,主要在胚胎期表達(dá),在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中通過(guò)介導(dǎo)位于軸突末端高度能動(dòng)和敏感的結(jié)構(gòu)-生長(zhǎng)錐[8]的崩解來(lái)促使軸突生長(zhǎng)方向的逆轉(zhuǎn),從而起到對(duì)軸突生長(zhǎng)的定向?qū)Ш阶饔肹9]。而近年來(lái)研究表明,成年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中也有 Sema3A的表達(dá),尤其在神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷后,Sema3A有一定的表達(dá)上調(diào)[4,5,10]。已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后形成膠質(zhì)瘢痕,侵入損傷核心區(qū)的腦脊膜成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)分泌型 Sema3A[11],并且外周神經(jīng)損傷后,脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)發(fā)出的軸突不能穿越有 Sema3A表達(dá)的瘢痕組織[12]。

既往研究已經(jīng)證實(shí),Sema3A在體內(nèi)對(duì)胚胎發(fā)育中的神經(jīng)元起到軸突導(dǎo)向的作用[9]。本次實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的新生乳鼠大腦皮層神經(jīng)元為細(xì)胞模型,予以外源性蛋白 Sema3A(終濃度 0.5mg/ml)處理 24h后,可通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察到神經(jīng)元生長(zhǎng)錐發(fā)生崩解,說(shuō)明出生后動(dòng)物的神經(jīng)元仍然對(duì)于 Sema3A敏感,在體外 Sema3A對(duì)于新生動(dòng)物的神經(jīng)元同樣具有誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐崩解的作用。

已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,Sema3A在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的膠質(zhì)瘢痕中表達(dá),起到抑制神經(jīng)元軸突延伸的作用[11],而相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)將體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元予以 Sema3A(終濃度 5mg/ml)處理48h,可觀察到神經(jīng)元軸突變得纖細(xì),部分細(xì)胞發(fā)生軸突退化與崩解;從而在細(xì)胞水平證明了 Sema3A對(duì)于出生后動(dòng)物的神經(jīng)元,可發(fā)揮明顯的誘發(fā)軸突損傷及抑制軸突生長(zhǎng)的作用。另外,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度的 Sema3A處理神經(jīng)元,觀察到隨著 Sema3A劑量梯度增加,細(xì)胞存活率逐漸下降;提示 Sema3A不僅抑制軸突生長(zhǎng),而且隨其濃度增加也逐漸具有一定的神經(jīng)元毒性。并且,已有文獻(xiàn)報(bào)道,Sema3A在一定濃度范圍內(nèi)能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡[13]。那么,Sema3A作為一種軸突導(dǎo)向因子,不僅在軸突導(dǎo)向方面發(fā)揮作用,在特定的因素誘導(dǎo)下,可能通過(guò)某種抑制性信號(hào)導(dǎo)致神經(jīng)元活性降低甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡,而其軸突導(dǎo)向和細(xì)胞死亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否通過(guò)同一條信號(hào)通路,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)觀察,并結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道,可以推測(cè),由Sema3A激活的抑制性信號(hào)不僅局限于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期,其在動(dòng)物出生乃至成年后仍然發(fā)揮作用。在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷后,在病理性細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,病灶周圍處于應(yīng)激狀態(tài)但仍有活力的神經(jīng)元或相關(guān)膠質(zhì)細(xì)胞可能會(huì)分泌 Sema3A等抑制性軸突導(dǎo)向因子,繼而被周圍細(xì)胞表面 Sema3A受體復(fù)合體Neurotrophin-1/Plexin-A1(Nrp-1/PlexinA-1)[14]所識(shí)別,最終激活胞內(nèi)信號(hào)通路,導(dǎo)致軸突損傷,甚至細(xì)胞死亡。

綜上所述,在正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中,Sema3A起到重要的軸突導(dǎo)向作用,以確保建立精密有效的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),而在成年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,Sema3A可能通過(guò)誘導(dǎo)軸突損傷,對(duì)軸突再生產(chǎn)生消極影響,阻礙新的軸突網(wǎng)絡(luò)的建立形成,并進(jìn)一步誘發(fā)神經(jīng)元損傷甚至凋亡。然而對(duì)于 Sema3A誘發(fā)軸突損傷的機(jī)制,其激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何,本實(shí)驗(yàn)未做深入研究。對(duì)于 Sema3A誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突損傷的實(shí)驗(yàn)研究有助于闡釋 Sema3A在神經(jīng)元死亡早期所起到的初始引發(fā)作用,進(jìn)而為早期神經(jīng)保護(hù)提供新的靶點(diǎn)和思路。

[1]Wakade TD,Palmer KC,Mccauley R,etal.Adenosine-induced apoptosis in chick embryonic sympathetic neurons：a new physiological role for adenosine[J].JPhysiol,1995,488(Pt 1)：123-138.

[2]Raff MC,Whitmore A,Finn JT.Axonal self-destruction and neurodegeneration[J].Science,2002,296(5569)：868-871.

[3]Luo Y,Raible D,Raper JA.Collapsin：a protein in brain that induces the collapse and paralysisof neuronal growth cones[J].Cell,1993,75(2)：217-227.

[4]Pasterkamp RJ,Giger RJ,Ruitenberg MJ,etal.Expression of the gene encoding the chemorepellent semaphorin IIIis induced in the fibroblast component of neural scar tissue formed following injuries of adult but not neonatal CNS[J].Mol Cell Neurosci,1999,13(2)：143-166.

[5]Hou ST,Keklikian A,Slinn J,etal.Sustained up-regulation of semaphorin 3A,Neuropilin1,and doublecortin expression in ischem ic mouse brain during long-term recovery[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,367(1)：109-115.

[6]Pasterkamp RJ,Verhaagen J.Semaphorins in axon regeneration：developmental guidancemolecules gone wrong[J]?Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2006,361(1473)：1499-1511.

[7]Chilton JK.Molecular mechanisms of axon guidance[J].Dev Biol,2006,292(1)：13-24.

[8]Lowery LA,Van Vactor D.The trip of the tip：understanding the growth conemachinery[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10(5)：332-343.

[9]Yazdani U,Terman JR.The semaphorins[J].Genome Biol,2006,7(3)：211.

[10]Klebanov O,Nitzan A,Raz D,etal.Upregulation of Semaphorin 3A and the associated biochem ical and cellular events in a ratmodel of retinal detachment[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2009,247(1)：73-86.

[11]Niclou SP,Franssen EH,Ehlert EM,etal.Meningeal cell-derived semaphorin 3A inhibits neurite outgrowth[J].Mol Cell Neurosci,2003,24(4)：902-912.

[12]DeWinter F,Oudega M,Lankhorst AJ,etal.Injury-induced class 3 semaphorin expression in the ratspinal cord[J].Exp Neurol,2002,175(1)：61-75.

[13]Shirvan A,Ziv I,Fleminger G,etal.Semaphorins as mediators of neuronal apoptosis[J].JNeurochem,1999,73(3)：961-971.

[14]Takahashi T,Fournier A,Nakamura F,etal.Plexin-neuropilin-1 complexes form functional semaphorin-3A receptors[J].Cell,1999,99(1)：59-69.