謝 放，張生香，陳京津，魏孔麗，朱子雄

(蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

恒溫和變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及菌核形成影響的比較研究

謝 放，張生香，陳京津，魏孔麗，朱子雄

(蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

為了探究恒溫和變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的影響，設(shè)置－9℃ ～30℃的7個(gè)恒溫處理，3個(gè)變溫處理，通過(guò)觀察和記錄在兩種不同培養(yǎng)方式下菌絲的長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度、菌落干重、產(chǎn)核時(shí)間、菌核數(shù)量等內(nèi)容，從而比較出恒溫和變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的影響效果。結(jié)果表明，在恒溫條件下羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和菌核發(fā)育比變溫好，20℃最適宜菌絲生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌落干重最大;25℃最適宜菌核生長(zhǎng)發(fā)育，產(chǎn)核最早，菌核數(shù)量最多。

羊肚菌;恒溫;變溫;菌絲;菌核

羊肚菌(Morchella esculenta)是一種野生名貴食藥用真菌，常于春末夏初發(fā)生，因含高蛋白、低脂肪、富含氨基酸和維生素，營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美而深受人們歡迎［1］。羊肚菌菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和菌核的形成及其生長(zhǎng)發(fā)育是其生活史的重要階段，也是子實(shí)體產(chǎn)生與否的關(guān)鍵［2，12］，其中溫度是羊肚菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的關(guān)鍵因子，目前有關(guān)溫度影響羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和菌核發(fā)育報(bào)道的很多［3－6，10］，但是關(guān)于變溫影響羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及菌核發(fā)育的研究在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，因此，比較恒溫和變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及菌核發(fā)育的研究，進(jìn)一步確定兩種培養(yǎng)方式的優(yōu)劣無(wú)疑具有重要的意義，為羊肚菌的基礎(chǔ)理論研究提供科學(xué)理論知識(shí)，進(jìn)而為實(shí)現(xiàn)羊肚菌子實(shí)體的商業(yè)化批量生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羊肚菌(Morchella esculenta)采集于甘南州迭部縣。

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，DF205型電熱鼓風(fēng)干燥箱，電子天平等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基 試驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、水 1 000 mL，pH 自然。

1.3.2 菌種制備 將已培養(yǎng)好的斜面菌種，接種于9 cm的PDA平板上，25℃培養(yǎng)3～4 d，然后用已滅過(guò)菌的6mm打孔器切下長(zhǎng)好的菌絲體塊并轉(zhuǎn)接于固體PDA平板培養(yǎng)基上。

1.3.3 不同溫度試驗(yàn) 按常規(guī)方法，將菌種接種在PDA平板上，然后分7個(gè)處理，分別于－9℃、2℃、8℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌絲和菌核生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落干重。

1.3.4 變溫試驗(yàn) 接種方法與上述同，分3個(gè)不同溫度區(qū)間，二段式變溫，低溫區(qū)12℃，高溫區(qū)15℃(12～15℃)、低溫區(qū)15℃，高溫區(qū)20℃(15～20℃)、低溫區(qū)20℃，高溫區(qū)25℃(20～25℃，培養(yǎng)時(shí)間為低溫區(qū)和高溫區(qū)各12 h。

1.3.5 菌絲體培養(yǎng)特征觀察 每隔24 h，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)，氣生菌絲密度，當(dāng)菌絲體培養(yǎng)到第4天(96h)時(shí)，以菌絲將近長(zhǎng)滿而未長(zhǎng)滿平皿時(shí)作為測(cè)量終點(diǎn)，以接種塊為中心用刻度尺測(cè)量菌落直徑(mm)，隨機(jī)測(cè)量3次，取平均值。菌絲日均長(zhǎng)速計(jì)算方法［7］：

最后取3個(gè)重復(fù)的平均值。

1.3.6 菌核培養(yǎng)特征觀察 每隔24 h觀察菌核是否形成，記錄形成菌核時(shí)間，培養(yǎng)到30 d時(shí)，觀察記錄菌核分布和顏色特征，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中形成的菌核數(shù)量［8］。

1.3.7 菌落干重測(cè)定 菌絲體培養(yǎng)到第5天時(shí)，將菌絲體連同培養(yǎng)基一同放入盛有蒸餾水的燒杯中，每個(gè)平板對(duì)應(yīng)一個(gè)燒杯，然后將燒杯在微波爐中加熱，直至培養(yǎng)基完全熔化，用玻璃棒挑出菌絲，置于濾紙上吸收多余的水分后，于DF205型電熱鼓風(fēng)干燥箱中105℃烘至恒重后稱重，設(shè)置3個(gè)重復(fù)［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度及變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(見表1)，不同溫度恒溫和變溫培養(yǎng)對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有差異顯著，羊肚菌菌絲在－9℃不能生長(zhǎng)，而在2～30℃之間，菌絲均能生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)、氣生菌絲密度、菌絲形態(tài)和菌落干重都存在很大差異，具體分析如下：

2.1.1 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)的影響

由表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，羊肚菌菌絲在2～25℃之間生長(zhǎng)速度與溫度之間成正比關(guān)系，日均長(zhǎng)速隨溫度升高而加快，25℃生長(zhǎng)速度達(dá)到頂峰，達(dá)10.064 mm/d;菌絲長(zhǎng)勢(shì)也隨著溫度升高而旺盛，氣生菌絲密度隨溫度升高而更加稠密，25℃是菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、氣生菌絲密度最稠密的溫度條件，當(dāng)溫度大于25℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度下降、菌絲長(zhǎng)勢(shì)和氣生菌絲密度均減弱、說(shuō)明過(guò)高溫度會(huì)加速菌絲老化，容易發(fā)黃。

2.1.2 不同溫度對(duì)菌落干重的影響 從表1的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，同樣，菌落干重與溫度也具一定的相關(guān)性，在2～20℃菌落干重隨溫度升高而隨之增加，而且20℃菌落干重達(dá)到了頂峰，為211.8 mg，溫度大于20℃時(shí)，菌落干重隨溫度呈直線式下降，在30℃時(shí)菌落干重僅僅40.83 mg。

2.1.3 不同溫度下菌絲形態(tài)觀察 由表1可知，在不同溫度培養(yǎng)下菌絲形態(tài)也存在差異，有直立生長(zhǎng)的，有鋪在培養(yǎng)基表面絨絮狀或氈戎狀的，也有絲狀輻射生長(zhǎng)的，但是菌絲形態(tài)隨著溫度升高總的趨勢(shì)是：在溫度低于15℃條件下菌絲鋪在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，隨著溫度升高菌絲密度逐漸增加，進(jìn)而形成絨絮狀或氈戎狀的菌絲形態(tài)。

2.1.4 恒溫和變溫對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的比較 根據(jù)表1恒溫和變溫兩種培養(yǎng)方式下的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，15℃以上條件下，菌絲的長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度以及氣生菌絲密度等變溫培養(yǎng)均不及恒溫培養(yǎng)好，說(shuō)明恒溫條件下，菌絲生長(zhǎng)穩(wěn)定，體內(nèi)酶系統(tǒng)受到的干擾少，而變溫會(huì)引起生物的應(yīng)急反應(yīng)，干擾菌絲體細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)的穩(wěn)定，由此表現(xiàn)出代謝降低、生長(zhǎng)速度減慢。只有12℃ ～15℃溫度范圍條件下，升溫對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)的作用大于變溫對(duì)生長(zhǎng)的干擾作用。

表1 不同溫度恒溫與變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 不同溫度及變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌核生長(zhǎng)發(fā)育的影響

表2研究結(jié)果表明，羊肚菌在－9℃、30℃條件下不產(chǎn)生菌核，在2～25℃范圍內(nèi)均能產(chǎn)生菌核，而且菌核形狀一致，均為球狀，但在菌核分布、產(chǎn)核時(shí)間、菌核數(shù)量、顏色上均存在明顯差異。

2.2.1 不同溫度對(duì)產(chǎn)核時(shí)間和菌核數(shù)量的影響

從表2試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，15℃、20℃、25℃同一天產(chǎn)核，產(chǎn)核最早，第10天產(chǎn)核，而且在25℃下產(chǎn)生的菌核數(shù)量最多，平均達(dá)到132個(gè)，而2℃產(chǎn)核最晚，第20天才產(chǎn)核，菌核數(shù)量最少，平均僅產(chǎn)生了4個(gè)，而且不能成熟。30℃不產(chǎn)核，這是由于偏高的溫度下菌株的長(zhǎng)勢(shì)差，后期迅速老化，故不易產(chǎn)核。由此可知，產(chǎn)核時(shí)間與溫度相關(guān)不大，但是菌核數(shù)量與溫度有直接的關(guān)系，25℃產(chǎn)核數(shù)量最多，表明25℃是產(chǎn)生菌核的最佳溫度。

表2 不同溫度恒溫與變溫培養(yǎng)對(duì)羊肚菌菌核形成及生長(zhǎng)發(fā)育影響

2.2.2 不同溫度對(duì)菌核分布、大小和顏色的影響

由表2可知，菌核分布呈現(xiàn)隨機(jī)性，有分散分布、培養(yǎng)皿邊緣分布、培養(yǎng)皿邊緣密集分布等形式，但菌核大小、數(shù)量和顏色與溫度直接相關(guān)，隨著溫度升高，數(shù)量增加，單個(gè)菌核體積增加，顏色由白色加深至黃褐色，2℃、8℃培養(yǎng)雖然能產(chǎn)生菌核，但是菌核顏色一直呈白色，說(shuō)明低于8℃溫度下產(chǎn)生的菌核發(fā)育不成熟。這與李素玲等［2］報(bào)道一致，菌核發(fā)育成熟的變化過(guò)程表現(xiàn)為：針尖大的幼菌核由淡黃色→中心杏黃、四周淡黃色→棕色→深棕色→污棕色的老齡菌核團(tuán)(堆)。

2.2.3 恒溫和變溫對(duì)菌核生長(zhǎng)發(fā)育影響的比較

根據(jù)表2恒溫和變溫兩種培養(yǎng)方式下的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，變溫培養(yǎng)不利于菌核的生長(zhǎng)發(fā)育，產(chǎn)核時(shí)間、菌核大小和數(shù)目均不及恒溫培養(yǎng)好。從產(chǎn)核時(shí)間、菌核大小和顏色比較來(lái)看，變溫區(qū)培養(yǎng)的菌核質(zhì)量不如恒溫好，變溫比恒溫培養(yǎng)產(chǎn)核時(shí)間推遲5～11天，菌核數(shù)量顯著減少。

3 討論

3.1 關(guān)于最適宜的溫度范圍問(wèn)題

在菌絲和菌核生長(zhǎng)發(fā)育的最適宜溫度范圍方面，前人已經(jīng)有所報(bào)道，但是本試驗(yàn)結(jié)論與前人的研究結(jié)果略顯差異，第一，在適宜菌絲體生長(zhǎng)溫度方面，陳易飛等報(bào)道羊肚菌菌絲體在2～34℃之間均能生長(zhǎng)，其中24～26℃為最適生長(zhǎng)溫度，34.5℃為致死溫度［4］，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌菌絲在2～30℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，其中15～25℃是菌絲最適生長(zhǎng)溫度;第二，在適宜菌核發(fā)育溫度方面，劉興蓉，陳芳草等研究結(jié)果：羊肚菌在5～30℃范圍內(nèi)均能產(chǎn)生菌核，而菌株A的最佳產(chǎn)核溫度范圍為15～20℃之間，菌株B在5～30℃的較寬溫度范圍內(nèi)產(chǎn)核［9］，本試驗(yàn)研究結(jié)果為羊肚菌在2～25℃溫度范圍內(nèi)均能產(chǎn)核，20～25℃是最佳產(chǎn)核范圍;第三，變溫對(duì)菌核生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種在恒溫條件下產(chǎn)核時(shí)間、菌核數(shù)量、大小、菌核成熟度均比變溫處理的好，本結(jié)果跟劉興蓉等(2004)羊肚菌產(chǎn)核條件的研究結(jié)果一致，作者認(rèn)為菌株A、菌株B在恒溫條件下菌核長(zhǎng)勢(shì)、數(shù)量以及產(chǎn)核時(shí)間均比變溫處理好［10］?？梢?，菌絲生長(zhǎng)和菌核發(fā)育的最適溫度范圍存在差異，主要是由于菌株來(lái)源和遺傳背景不同，同時(shí)也反映了羊肚菌生理特性的多樣性［11］。

3.2 關(guān)于恒溫和變溫的影響

羊肚菌在自然界全是變溫的環(huán)境，沒(méi)有恒溫條件，菌絲和菌核的生長(zhǎng)發(fā)育應(yīng)該完全適應(yīng)變溫條件，但本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果是恒溫比變溫好，其原因如下：第一，自然界的變溫是一個(gè)緩慢的過(guò)程，菌絲細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)能夠適應(yīng)緩慢變化的環(huán)境條件，而在實(shí)驗(yàn)室條件下溫度突然升高或降低，使菌絲和菌核不能很好適應(yīng)溫度的劇烈式變化，使其細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，從而影響了菌絲和菌核的生長(zhǎng)發(fā)育;第二，變溫范圍與時(shí)段的設(shè)置可能不夠合理，本試驗(yàn)只是一個(gè)小范圍的變溫，自然界的變溫區(qū)間大，所以，如果變溫時(shí)段與溫差范圍進(jìn)行模擬自然環(huán)境設(shè)置，是否會(huì)有另外結(jié)果，需要今后繼續(xù)研究。

3.3 關(guān)于最佳溫度問(wèn)題

前人在研究關(guān)于菌絲生長(zhǎng)和菌核發(fā)育最佳溫度方面，只是限于單方面因素，把菌絲長(zhǎng)速最快，菌落干重最大，產(chǎn)核時(shí)間最早，數(shù)量最多分開考慮，從而得出菌絲生長(zhǎng)和菌核發(fā)育的最佳溫度，但是本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，菌絲生長(zhǎng)速度快不一定菌落干重大，25℃菌絲生長(zhǎng)速度最快，但是其菌落干重小于20℃的菌落干重，其原因是生長(zhǎng)速度快，菌絲體內(nèi)積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少，所以25℃的菌落干重不及20℃的菌落干重。這個(gè)現(xiàn)象或許在食用菌或者在羊肚菌袋料栽培中是一個(gè)很好的操作依據(jù)，應(yīng)該把菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌落干重最大，產(chǎn)核時(shí)間最早，菌核數(shù)量最多結(jié)合考慮，從而設(shè)置相應(yīng)的溫度，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)論，在食用菌或者羊肚菌袋料栽培中，菌絲生長(zhǎng)階段將溫度設(shè)置為菌絲最適的溫度，使其快速吃料，以免污染，然后將溫度降低到最適溫度以下，降低菌絲生長(zhǎng)速度，使其在體內(nèi)積累更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這樣培養(yǎng)出來(lái)的子實(shí)體或許質(zhì)量更好。

4 小結(jié)

(1)菌絲生長(zhǎng)和菌核發(fā)育的最適宜溫度范圍分別為：15～25℃和20～25℃。

(2)25℃菌絲生長(zhǎng)速度比20℃略高一點(diǎn)，但是20℃菌落干重遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)25℃的菌落干重，所以20℃是羊肚菌菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的最佳溫度。

(3)15℃、20℃、25℃同一天產(chǎn)核，但是25℃菌核數(shù)量最多，因此25℃是羊肚菌菌核形成及生長(zhǎng)發(fā)育的最佳溫度。

(4)在恒溫和變溫培養(yǎng)方面，在15℃以上的相同溫度范圍內(nèi)，恒溫比變溫培養(yǎng)好。

［1］ 侯集瑞，李 玉，圖力吉爾，等.赤霉素和α－萘乙酸對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23(4)：41－43.

［2］ 李素玲，尚春樹，施安融，等.羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)特性及菌核培養(yǎng)特征的初步觀察［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，26(2)：72 －75.

［3］ 李 潔，張?jiān)葡?，邱德?不同因素對(duì)羊肚菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響［J］.河北林業(yè)科技，2004(2)：1－2.

［4］ 張 松，胡蝦妹，謝海燕.尖頂羊肚菌液體培養(yǎng)基質(zhì)與條件的研究［J］. 菌物研究，2004，2(4)：11－15.

［5］ 楊 芳，王新風(fēng)，朱 駿，等.肋脈羊肚菌液體培養(yǎng)條件的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(2)：280 －282.

［6］ 歐 超，王 娣，張兆軒，等.羊肚菌液體深層發(fā)酵條件［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26(2)：80 －84.

［7］ 董 雪.黑麥羊肚菌生物學(xué)特性研究［D］.北京師范大學(xué)碩士研究生論文，2004：38 －39.

［8］ 鄭 磊，程顯好，王淑芳.五種碳源對(duì)核盤菌絲生長(zhǎng)及菌核形成的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(4)：1366－1367.

［9］ 陳易飛，郭益紅.溫度、PH對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與新農(nóng)村建設(shè)，1998，21(5)：28 －29.

［10］ 劉興蓉，陳芳草，譚方河，等.羊肚菌產(chǎn)核條件研究［J］.四川林業(yè)科技，2004，25(3)：44 －46.

［11］ 彭 璐，常繼東.羊肚菌菌絲體培養(yǎng)特性的研究［J］.食用菌，2006(5)：10 －12.

［12］ 任桂梅，張少剛.羊肚菌的研究進(jìn)展［J］.延安大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18(1)：58 －59.

Effects of Constant and Variable Temperature Cultivation on the Mycelium Growth and Sclerotia Formation of Morchella esculenta

Xie Fang，Zhang Shengxiang，Chen Jingjing，Wei Kongli，Zhu Zixiong
(College of Chemical and Biological Engineering Lanzhou Jiao Tong University，Lanzhou 730070，China)

In order to explore the effects of constant temperature and variable－temperature cultivation on the mycelial growth and sclerotium formation of Morchella esculenta，set－9℃ to 30℃ 7 constant temperature treatments and three variable－temperature treatments by observing and recording the growth rate of myclium，dry weight of colony，the production of sclerotium time，the number of sclerotia and other content at the two different of cultivation modes to compare the outcome of effect of constant temperature and variable－temperature cultivation on the mycelial growth and sclerotium formation.The results show that in the constant temperature conditions，the growth of mycelium and sclerotium formation better than the variable temperature，20℃ is the best for mycelial growth，the growth faster of mycelial and the largest dry weight of colony;25℃ is best for sclerotium growth，the earliest production of sclerotium，the largest number of sclerotia.

Morchella;constant temperature;variable temperature;mycelium;sclerotium

Q935

A

1006－9690(2010)03－0037－04

10.3969/j.issn.1006－ 9690.2010.03.009

2009－11－10

謝放(1962－)，男，甘肅蘭州人，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：資源與環(huán)境微生物學(xué)