(東北大學(xué) 材料與冶金學(xué)院，遼寧 沈陽，110819)

細(xì)菌胞外聚合層(Extracellular polymers，EPS)普遍存在于微生物群體中，它是附著在細(xì)菌表面或圍繞在細(xì)菌周圍的菌體新陳代謝產(chǎn)物[1]，呈現(xiàn)松散透明黏液狀或是膠質(zhì)狀[2]；其主要成分為多糖、蛋白質(zhì)、脂肪等[3?4]。細(xì)菌胞外聚合層可用于細(xì)菌個體的自我保護(hù)、黏附聚集、空間構(gòu)型、信息交流等[5?6]。在生物冶金中，細(xì)菌胞外聚合層是浸礦反應(yīng)的發(fā)生場所[7]，具有調(diào)節(jié)硫化物表面吸附，影響離子交換，提高氧化活性等作用[8?9]。采用苯酚?硫酸法可測定浸礦細(xì)菌胞外聚合層中多糖的含量。該比色法的測定原理是：在強(qiáng)酸條件下，多糖在濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫下迅速水解成單糖，并脫水生成糠醛衍生物，該衍生物與苯酚反應(yīng)在 490 nm處有最大吸收峰的橙黃色物質(zhì)，且其吸光度與濃度呈線性關(guān)系[10?11]。應(yīng)用苯酚?硫酸法測定不同的糖類物質(zhì)，其最佳測定條件不同，應(yīng)以待測多糖作為研究對象，找出其最適測定條件，才能得到較準(zhǔn)確的測定結(jié)果[12?13]。本文選取浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖為研究對象，通過單因素條件實(shí)驗(yàn)，得出苯酚?硫酸法測定該多糖的最佳條件，并通過紅外光譜分析檢測該多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以便為進(jìn)一步研究浸礦過程中細(xì)菌胞外聚合層與礦物之間的作用機(jī)理提供技術(shù)支持。

1 材料及方法

1.1 菌種

供試菌種為HQ0211菌。該菌是混合浸礦菌株，由主體菌嗜酸氧化亞鐵硫桿菌以及嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵微螺菌組成，其以Fe2+和S為能源，在pH為1.0～2.5、溫度為25～46 ℃條件下自養(yǎng)。

1.2 待測多糖的制備

1.2.1 培養(yǎng)菌液

菌液采用搖瓶培養(yǎng)：9K 培養(yǎng)基[14?15]內(nèi)接入 10%的種子液(種子液的菌體質(zhì)量濃度為108g/L)，初始pH調(diào)至1.7，控溫為44 ℃，轉(zhuǎn)速為190 r/min，待菌液生長至電位達(dá) 600 mV以上，得到生長處于穩(wěn)定期的菌液。

1.2.2 胞外聚合層中多糖的提取

取3.0 mL培養(yǎng)的菌液于離心管中，以11 500 r/min常溫離心12 min，收集沉淀，沉淀中加入3.0 mL 3%EDTA溶液，混勻，以11 500 r/min再次常溫離心12 min，上清液用孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液為待測的多糖樣品。

1.3 測定指標(biāo)

多糖含量的測定采用苯酚?硫酸法，使用TU?1901紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度；多糖化學(xué)鍵的結(jié)構(gòu)分析采用Spectrum One紅外光譜儀掃描，固體樣品采用KBr壓片。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳測定條件的選擇

2.1.1 最大吸收波長

取多糖樣品1.0 mL置于試管中，加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，混合均勻后在室溫下顯色20 min，得待測多糖的顯色液。以蒸餾水代替多糖，同樣按上述方法顯色，作為空白樣。采用分光光度計(jì)掃描顯色液的波長，掃面范圍設(shè)置為440～540 nm，根據(jù)掃描結(jié)果，確定最大吸收峰對應(yīng)的波長為最大吸收波長。吸光度隨測定波長的變化如圖1所示。從圖1可見：在440～540 nm的掃描區(qū)域，顯色液的吸光度先增大后減小，且于490 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，這說明浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖顯色液的最大吸收波長為490 nm。

圖1 多糖顯色液的波長掃描圖譜Fig.1 Wavelength scanning graph of polysaccharide color liquid

2.1.2 濃硫酸用量

取多糖樣品1.0 mL分別置于不同編號的試管中，依次加入濃硫酸4.0，4.5，5.0，5.5和6.0 mL，混勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，于室溫下顯色20 min。同樣做每種濃硫酸用量的空白樣品實(shí)驗(yàn)，并在最大波長490 nm處測定顯色液的吸光度。吸光度隨濃硫酸用量的變化結(jié)果如圖2所示。由圖2可見：顯色液的吸光度在濃硫酸用量為5.0 mL時(shí)達(dá)到最大，此后吸光度不隨濃硫酸用量的增加而增大，而是略有減小。這表明實(shí)驗(yàn)中濃硫酸的用量存在最適值，即5.0 mL，高于或低于此用量時(shí)，都不能達(dá)到最佳的顯色效果。

圖2 濃硫酸用量對吸光度的影響Fig.2 Influence of sulfuric acid on absorbance

2.1.3 苯酚溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)

采用確定的最大吸收波長和最佳濃硫酸用量，改變苯酚溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別設(shè)定為3%，4%，5%，6%和7%，其他操作條件相同，同樣做每種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的空白樣品實(shí)驗(yàn)，測定多糖顯色液的吸光度。圖3所示為吸光度隨苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化結(jié)果?？梢姡寒?dāng)使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%的苯酚溶液時(shí)，顯色液的吸光度達(dá)最大值，而且明顯大于其他顯色液的吸光度。該結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)中苯酚溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制為 5%時(shí)可達(dá)最佳測定效果，即該質(zhì)量分?jǐn)?shù)的苯酚溶液恰好與糠醛衍生物充分反應(yīng)。

圖3 苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)對吸光度的影響Fig.3 Influence of concentration of phenol on absorbance

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間

按照確定的最佳測定條件，將所用多糖樣品和試劑全部加入后，迅速混勻，并采用掃描的方法測定反應(yīng)時(shí)間，掃描時(shí)間設(shè)置為1 200 s。吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化結(jié)果如圖4所示。根據(jù)圖4可知，當(dāng)多糖樣品和試劑混合后，反應(yīng)立即發(fā)生，吸光度波動；反應(yīng)發(fā)生200 s后結(jié)束，吸光度穩(wěn)定。此結(jié)果說明：用苯酚?硫酸法測定浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含量時(shí)，多糖和試劑反應(yīng)200 s后吸光度才能穩(wěn)定。

2.2 精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

按照最佳測定條件，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表 1所示。從表1可知：6次平行實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.75%，低于2.00%，這表明采用苯酚?硫酸法測定浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含量，結(jié)果精密度較高。

圖4 多糖顯色液的反應(yīng)時(shí)間掃描圖譜Fig.4 Scanning graph of reaction time for polysaccharide color liquid

表1 平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Parallel experimental results

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取多糖樣品1.0 mL，按上述最佳測定條件比色，測定顯色15，30，45，60，75和90 min時(shí)的吸光度，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知：多糖顯色液在比色后的15～90 min內(nèi)，吸光度穩(wěn)定在一條直線上，基本不變。這表明采用苯酚?硫酸法測定浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含量時(shí)，顯色液可穩(wěn)定顯色90 min，即在多糖顯色的90 min內(nèi)，顯色液的吸光度均為有效值。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用干燥至恒重的蔗糖準(zhǔn)確配置質(zhì)量濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取該蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL于試管中，并分別用蒸餾水補(bǔ)至體積為1.0 mL，按照最佳測定條件比色，以蒸餾水做空白樣品實(shí)驗(yàn)，測定吸光度，繪制蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。該曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.999，這表明：當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為0～0.03 g/L時(shí)，質(zhì)量濃度與吸光度之間基本符合郎伯?比爾定律，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；即使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，可科學(xué)地計(jì)算多糖含量。

圖5 多糖顯色液的吸光度隨時(shí)間的變化曲線Fig.5 Absorbance curve for polysaccharide color liquid changing along with time

圖6 蔗糖質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系Fig.6 Relationship between sucrose concentration and adsorption

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收波長

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液的吸收波長如圖7所示。由圖7可以看出：蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收波長也為490 nm，與提取的多糖顯色液的一致。由此說明，提取的多糖與蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液有相同的最大吸收波長；因而可根據(jù)蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算浸礦細(xì)菌胞外聚合層中多糖的含量。

2.4 多糖含量的測定

將平行實(shí)驗(yàn)得到的吸光度平均值0.119代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，計(jì)算出提取的浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含量為12 mg/L。

2.5 多糖的紅外光譜檢測

圖7 蔗糖顯色液的波長掃描圖譜Fig.7 Wavelength scanning graph of sucrose color liquid

表2 多糖的紅外吸收峰Table 2 Infrared absorption band of polysaccharide

采用紅外光譜分析浸礦細(xì)菌胞外聚合層中多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表2。從表2可知，提取的多糖具有O—H，C=C，—CH3和C—H鍵，這些化學(xué)鍵符合糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，其可組成多糖的主體構(gòu)架。

3 結(jié)論

(1) 采用苯酚?硫酸法測定浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含量，其最佳測定條件如下：比色波長為490 nm，濃硫酸用量為5.0 mL，苯酚溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，反應(yīng)時(shí)間200 s，顯色反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間為90 min。

(2) 測定浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含量時(shí)，苯酚?硫酸法具有較高的精密度和穩(wěn)定性；選用蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可以客觀地計(jì)算提取的多糖含量；測得的穩(wěn)定期菌液的多糖含量為12 mg/L。

(3) 浸礦細(xì)菌胞外聚合層中的多糖含有 O—H，C=C，—CH3和C—H等化學(xué)結(jié)構(gòu)。

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