(中南大學(xué) 冶金科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410083)

竹簡(jiǎn)是中國(guó)在晉以前檔案的主要載體，對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)文明的傳播起了至關(guān)重要的作用。湖南長(zhǎng)沙簡(jiǎn)牘博物館收藏了一批走馬樓出土的三國(guó)時(shí)期吳國(guó)竹簡(jiǎn)，具有極為珍貴的史料價(jià)值。在出土后保存過(guò)程中，該批竹簡(jiǎn)爆發(fā)了一種竹簡(jiǎn)蝕斑病，竹簡(jiǎn)損害嚴(yán)重，白斑中的竹簡(jiǎn)竹體變?yōu)榘胪该髂钗镔|(zhì)。胡東波等[1]從走馬樓出土的帶菌竹簡(jiǎn)浸泡液中分離出未知的M菌、桔青霉、黃曲霉、黑曲霉等霉菌和副球菌，通過(guò)對(duì)竹簡(jiǎn)被侵害的特征以及竹簡(jiǎn)蝕斑病爆發(fā)的環(huán)境條件進(jìn)行分析，認(rèn)為其中的霉菌M菌是造成竹簡(jiǎn)腐蝕斑的主要侵害菌；Zeng等[2]采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基從該批爆發(fā)蝕斑病的竹簡(jiǎn)中分離出10株細(xì)菌，其中菌株Be-2反接回廢竹片，能使竹片的表面由原來(lái)的亮褐色變成黑褐色，且在竹片上形成的腐蝕斑與初始爆發(fā)的腐蝕斑相似。然而，目前還缺乏證據(jù)證明導(dǎo)致該批竹簡(jiǎn)發(fā)生蝕斑病的微生物的種群和分類(lèi)地位，病原菌還未得到分離，其快速侵蝕竹簡(jiǎn)的機(jī)制更是未知。本研究以該批爆發(fā)蝕斑病的竹簡(jiǎn)浸泡液為原料，采用適于各種微生物生長(zhǎng)的不同豐富培養(yǎng)基分離純化其中的微生物，并對(duì)獲得的純培養(yǎng)進(jìn)行多樣性分析，以期為進(jìn)一步研究不同種群微生物在竹簡(jiǎn)腐蝕過(guò)程中的作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。

高氏一號(hào)：KNO31 g，可溶性淀粉20 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L。

查氏培養(yǎng)基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L。

1.2 菌株分離與純化

將長(zhǎng)沙簡(jiǎn)牘博物館密封保藏的竹簡(jiǎn)浸泡液分別接種于牛肉膏蛋白胨、高氏一號(hào)以及查氏培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)物以稀釋平板法結(jié)合劃線分離法在相應(yīng)的固體平板上進(jìn)行分離，直至獲得各種微生物的純培養(yǎng)為止。培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.3 菌株基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析

1.3.1 細(xì)菌16SrDNA PCR

采用菌落 PCR擴(kuò)增所獲得的細(xì)菌的部分16SrDNA片段，從固體平板上挑取單克隆，用solutionⅡ(10 μL 10% SDS，2 μL 40% NaOH，88 μL超純水)裂解菌體，裂解液稀釋后作為模板，引物為細(xì)菌16SrDNA通用引物(27F，1492R)[3]。

1.3.2 真菌18SrDNA和ITS PCR

真菌基因組DNA采用氯化芐法[4]提取，根據(jù)真菌18SrDNA 保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。ITS(包括 ITS1，5.8SrDNA，ITS2)序列用通用引物ITS4和ITS5[5]擴(kuò)增，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3.3 序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖DNA回收試劑盒(天根，北京)切膠回收后，由上海生物工程有限公司完成測(cè)序。將得到的細(xì)菌16SrDNA、真菌18SrDNA以及ITS序列與NCBI中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，利用Mega 4.0軟件分析親緣關(guān)系、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 細(xì)菌多樣性分析

定義16SrDNA序列相似性小于97%作為不同的分類(lèi)單元，采用 Shannon Wienerps指數(shù)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Shannon多樣性指數(shù)H)計(jì)算多樣性[6]：

式中：s為物種(這里采用分類(lèi)單元)數(shù)目；Pi為屬于第i種的個(gè)體占全部個(gè)體的比例。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離及形態(tài)特征

長(zhǎng)沙簡(jiǎn)牘博物館密封保藏的腐蝕竹簡(jiǎn)浸泡液經(jīng)無(wú)菌操作接種于各種豐富培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)、分離純化后，共獲得8株細(xì)菌以及1株霉菌的純培養(yǎng)，分別命名為菌株B-1，B-2，B-3，B-4，B-6，B-7，B-8，B-9以及F-1。其菌落形態(tài)、革蘭氏染色和菌體形態(tài)如表1所示。

2.2 細(xì)菌16SrDNA序列與多樣性分析

2.2.1 16SrDNA序列分析

通過(guò)菌落PCR擴(kuò)增得8株細(xì)菌的16SrDNA 1 500 bp左右片段，經(jīng)測(cè)序獲得相關(guān)序列，將這些序列與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果如表2所示。所有分離得到的細(xì)菌 16SrDNA序列均與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的相關(guān)序列有較高的相似性(≥99%)。定義16SrDNA序列相似性低于 97%時(shí)作為不同分類(lèi)單元進(jìn)行多樣性計(jì)算，結(jié)果表明分離得到的8株細(xì)菌可分為7個(gè)不同的分類(lèi)單元，Shannon多樣性指數(shù)為2.92。

2.2.2 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

基于分離細(xì)菌 16SrDNA序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖 1)表明：這些細(xì)菌分別屬于 4個(gè)不同的綱，包括α-Proteobacteria(1 株)，β-Proteobacteria(3 株)，γ-Proteobacteria(1 株)以及 Bacilli(3 株)。

結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和基于分離細(xì)菌16SrDNA序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，Bacilli綱的3株細(xì)菌中 B-1和B-3屬于Bacillus，B-4為Staphylococcus，Bacillus是分離得到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；β-Proteobacteria綱的菌株 B-6，B-8和 B-9分別屬于Pandoraea，Cupriavidus和Comamonas；α-Proteobacteria綱的菌株B-7屬于Novosphingobium；γ-Proteobacteria綱的菌株B-2屬于Acinetobacter。

表1 各分離菌株形態(tài)學(xué)特征及革蘭氏染色情況Table 1 Morphological characteristic of the isolated strains

表2 分離細(xì)菌16SrDNA序列分析Table 2 Analysis of partial 16SrDNA gene sequences of the isolated strains

2.3 真菌的分類(lèi)鑒定

以氯化芐法提取霉菌F-1的基因組DNA，以此作為模板PCR擴(kuò)增得到該菌的18SrDNA和ITS部分片段，經(jīng)測(cè)序獲得相關(guān)序列，將這些序列與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果如表3所示。

從表3可知：霉菌F-1的18SrDNA和ITS 序列均與曲霉屬(Aspergillus)有很高相似性(99%)?；诿咕鶬TS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖2)表明：霉菌F-1與Aspergillus的關(guān)系密切，由此將霉菌F-1歸為曲霉屬的1個(gè)種。

圖1 基于分離細(xì)菌16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis based on the 16SrDNA sequences of the isolated strains

表3 霉菌F-1 18SrDNA及ITS序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Analysis of partial 18SrDNA and ITS of the isolated fungus

圖2 基于霉菌F-1 ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS sequences of the strain F-1

3 討論

湖南長(zhǎng)沙走馬樓出土的竹簡(jiǎn)的竹材經(jīng)鑒定為剛竹屬，竹材主要成分為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，另外還有少量的抽提物和灰分[7]。竹材的腐蝕是真菌、細(xì)菌共同作用的結(jié)果，吳開(kāi)云等[8?10]分離了大量能引起竹材霉變的霉菌，而關(guān)于細(xì)菌在竹材腐蝕中的作用研究較少。傅筱沖等[11]在土法造紙嫩毛竹自然發(fā)酵過(guò)程中分離純化得到了100株細(xì)菌，60株為芽孢桿菌，另外40株有微球菌、葡萄球菌、李氏桿菌、不動(dòng)桿菌、腸桿菌等，并發(fā)現(xiàn)其中的3株芽孢桿菌能使嫩毛竹明顯軟化。李超等[12]從毛竹林地的腐朽竹伐樁分離篩選出16株具有較好纖維素或木質(zhì)素降解能力的菌株，其中8株霉菌、5株細(xì)菌和3株放線菌。Zeng等[2]從走馬樓出土的竹簡(jiǎn)中分離出屬于4個(gè)屬的10株細(xì)菌，但這些菌株降解竹材的能力未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用牛肉膏蛋白胨、高氏一號(hào)和查氏培養(yǎng)基3種培養(yǎng)基分離竹簡(jiǎn)浸泡液中的微生物，得到8株細(xì)菌及 1株霉菌，屬于Bacillus，Acinetobacter，Staphylococcus，Pandoraea，Novosphingobium，Cupriavidus，Comamonas以及Aspergillus，呈現(xiàn)出豐富的生物多樣性。目前，已發(fā)現(xiàn)來(lái)自Bacillus，Acinetobacter以及Aspergillus中的一些菌株具有降解木質(zhì)素的能力。Chandra等[13]從造紙廢水中分離出 3株具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的Bacillussp.，6 d即可使木質(zhì)素降解 30%～40%；Gajanan等[14]從一株Acinetobactersp.中純化得到了木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。曲霉菌(Aspergillussp.)則是一種常見(jiàn)的木質(zhì)素、纖維素降解菌。習(xí)興梅等[15]從農(nóng)林廢物堆肥中分離得到一株黑曲霉，對(duì)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別為16.87%、39.85%和45.32%。Ahammed等[16]從紅樹(shù)林中分離得到一株Aspergillussp.，并測(cè)定了其木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性。木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的結(jié)構(gòu)單元中含有大量的芳香基和苯環(huán)結(jié)構(gòu)，Staphylococcus，Pandoraea，Novosphingobium，Cupriavidus和Comamonas的細(xì)菌未見(jiàn)報(bào)道參與木質(zhì)素降解，對(duì)芳烴類(lèi)、苯酚類(lèi)有機(jī)物的降解卻有較多報(bào)道。盧濤等[17]分離得到一株能降解鄰硝基酚細(xì)菌Staphylococcussp.；蔣析文等[18]對(duì)一株P(guān)andoraeasp.的氯苯降解機(jī)理進(jìn)行了深入的研究；崔志松等[19]從廈門(mén)近海海水中篩選到一株能夠降解多環(huán)芳烴的細(xì)菌Novosphingobiumsp.；Sanchez等[20]對(duì)一株 2, 4, 6-三氯苯酚降解菌Cupriavidus necatorJMP134的遺傳特性進(jìn)行了研究。吳建峰等[21]從污水處理廠分離了一株能以對(duì)氯硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長(zhǎng)的叢毛單胞菌(Comamonassp.CNB1)。因此，從三國(guó)吳簡(jiǎn)中分離出的菌株具有降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的潛力，其降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的能力和相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

(1) 采用細(xì)菌和真菌普通培養(yǎng)基，從腐蝕竹簡(jiǎn)浸泡液中共分離得到9株可培養(yǎng)菌株，其中有8株細(xì)菌，1株霉菌。

(2) 分析了從被腐蝕竹簡(jiǎn)中分離得到的 9株菌具有降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的潛力。

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