董靜梅,陳佩杰,劉舉科,余志琪

過(guò)度訓(xùn)練引起的大鼠心肌過(guò)氧化損傷與二聯(lián)苯碘與谷氨酰胺的合并干預(yù)作用

董靜梅1.2,陳佩杰2,劉舉科1,余志琪1

目的:探尋過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起的心肌過(guò)氧化損傷活性氧產(chǎn)生的途徑,實(shí)施活性氧產(chǎn)生途徑上的干預(yù)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)上的抗氧化防護(hù),為運(yùn)動(dòng)引起的心肌過(guò)氧化損傷的抗氧化干預(yù)提供方法學(xué)上的理論支撐;方法:85只雄性waster大鼠,隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(C)、單純過(guò)度運(yùn)動(dòng)組(E)、過(guò)度運(yùn)動(dòng)給予DPI干預(yù)組(D)、過(guò)度運(yùn)動(dòng)給予谷氨酰胺干預(yù)組(G)、過(guò)度運(yùn)動(dòng)合并給予DPI與谷氨酰胺干預(yù)組(DG),建立過(guò)度訓(xùn)練模型后的36 h和恢復(fù)7天后測(cè)定其血漿中的心肌肌鈣蛋白(cTn I)、肌酸同工酶(CK-MB)濃度以及心肌組織中的丙二醛(MDA),實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91-phox和p22-phox的mRNA的表達(dá);結(jié)果:與對(duì)照組比較,E組血漿MDA、cTn I、CK-MB均顯著升高,恢復(fù)7天后顯著下降, D、G組則升高幅度低于E組,DG組則變化不明顯,但干預(yù)組升高的幅度則顯著低于單純訓(xùn)練組。運(yùn)動(dòng)后36 h的gp91-phox、p22-phox的mRNA的表達(dá)也表現(xiàn)出同樣的變化特點(diǎn);結(jié)論:過(guò)度訓(xùn)練可引起心肌的過(guò)氧化損傷,其中,NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧是其過(guò)氧損傷的原因之一,NADPH氧化酶的抑制劑與谷氨酰胺合并時(shí)使用具有協(xié)同的抗氧化防護(hù)作用,可有效地防護(hù)過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起的心肌過(guò)氧化損傷。

大鼠;過(guò)度運(yùn)動(dòng);NADPH氧化酶;活性氧;心肌細(xì)胞;過(guò)氧化損傷;二聯(lián)苯碘;谷氨酰胺

長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起心肌損傷[20]從而影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力和身體健康。過(guò)度訓(xùn)練(overtraining OT)是指由于持續(xù)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練或者訓(xùn)練間歇時(shí)間過(guò)短而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列功能紊亂,嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練綜合征(Overtraining Syndroms,OTS)[11],因此,運(yùn)動(dòng)引起的心肌損傷的防護(hù)在方法學(xué)及理論機(jī)制方面的研究顯得尤為重要。有研究證明,過(guò)度訓(xùn)練由于體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)生成增多而使機(jī)體處在氧化脅迫狀態(tài)導(dǎo)致心肌的過(guò)氧化損傷[23],體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生途徑眾多,目前,較為公認(rèn)的運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)源性活性氧產(chǎn)生主要由線粒體電子漏產(chǎn)生[4]。但Kathy等[17](2006)的研究報(bào)道認(rèn)為,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH-oxidse)途徑是體內(nèi)ROS產(chǎn)生的新途徑,運(yùn)動(dòng)是否能激活心肌NADPH氧化酶?進(jìn)而產(chǎn)生ROS而導(dǎo)致心肌的過(guò)氧化損傷呢?為了驗(yàn)證過(guò)度運(yùn)動(dòng)是否引起此途徑活性氧的產(chǎn)生以及對(duì)心肌過(guò)氧化損傷進(jìn)行有效的防護(hù),本實(shí)驗(yàn)首先建立大鼠過(guò)度運(yùn)動(dòng)模型,在此基礎(chǔ)上,一方面,設(shè)計(jì)應(yīng)用了NADPH氧化酶的特異性抑制劑二聯(lián)苯碘(Diphenylene iodonium,DPI)來(lái)抑制NADPH氧化酶的活性,從而從途徑上切斷活性氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的過(guò)氧化損傷;另一方面,通過(guò)谷氨酰胺(Glutamine,Gln)的補(bǔ)充從心肌細(xì)胞的能量代謝和抗氧化防護(hù)中給予干預(yù)[5],在檢測(cè)過(guò)度運(yùn)動(dòng)后心肌損傷程度的特異性指標(biāo)心肌肌鈣蛋白-I(Cardiac troponin-I,CTn I)和肌酸同工酶(Creatine isoenzyme,CK-MB)及心肌脂質(zhì)過(guò)氧化程度,并利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基gp91-phox和p22-Phox的mRNA的表達(dá)的變化,探討過(guò)度運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的活性氧的新路徑以及對(duì)心肌損傷的過(guò)氧化機(jī)制,目的在于從活性氧產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的途徑及來(lái)源入手,結(jié)合谷氨酰胺相應(yīng)的抗氧化防護(hù)和營(yíng)養(yǎng)的調(diào)配,對(duì)運(yùn)動(dòng)引起的心肌的抗氧化防護(hù)提供一種新思路、新方法。

1 材料和方法

1.1 過(guò)度訓(xùn)練模型的建立

分組:85只雄性Vistar大鼠(體重225±6.7g,購(gòu)自上海BK生物技術(shù)有限公司),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后(環(huán)境溫度20℃～25℃,每天光照時(shí)間保證12 h,自由飲食水)。隨機(jī)取8只作為安靜對(duì)照組(C),其余繼續(xù)進(jìn)行4周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練后,隨機(jī)分為單純過(guò)度訓(xùn)練組(E,n=8)、過(guò)度訓(xùn)練DPI干預(yù)組(D,n=8)、過(guò)度訓(xùn)練谷氨酰胺干預(yù)組(G, n=8)、過(guò)度訓(xùn)練與DPI合并谷氨酰胺干預(yù)組(DG,n=8)。

訓(xùn)練模型:整個(gè)訓(xùn)練模型在參照巴西Hohl的方法[14]的基礎(chǔ)上(表1),在最后1周的訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)至大鼠力竭,力竭的標(biāo)準(zhǔn)以大鼠四肢無(wú)力支持住身體、頭部低垂、電刺激后不能繼續(xù)正常奔跑為力竭標(biāo)準(zhǔn)[21],成功建模的標(biāo)準(zhǔn)以同安靜組比較,單純過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿皮質(zhì)醇和睪酮在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性降低為據(jù)[4]。

給藥時(shí)間及劑量:從第5周開(kāi)始,D組在訓(xùn)練前0.5 h腹腔注射DPI(Sigma,產(chǎn)品編號(hào):D2926),給予濃度與方法參考[12],G組參考金其貫的方法給予L-谷氨酰胺(Sigma,產(chǎn)品編號(hào):G-3126)進(jìn)行干預(yù)[1],DG組按相同劑量與方法給予DPI與谷氨酰胺干預(yù),同時(shí),E組給予與D、G組相同方法相同劑量的安慰劑(即DPI與Glu的稀釋液分別為5%葡萄糖注射液和0.9%生理鹽水(上海醫(yī)藥產(chǎn)))。

表1 本研究11周遞增負(fù)荷的大鼠過(guò)度訓(xùn)練方案一覽表Table 1 The Protocol of Overtraining Cited by Hohl R

1.2 取材

11周的過(guò)度訓(xùn)練模型建立后進(jìn)行2次取材,第1次取材在末次訓(xùn)練的36～40 h,經(jīng)過(guò)7天同安靜組同等環(huán)境的休息后進(jìn)行第2次取材。每次取材均從各組隨機(jī)取8只大鼠,為避免運(yùn)動(dòng)應(yīng)激和麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,所有大鼠均保證在內(nèi)眼眶靜脈叢取1.5ml血樣后立即斷頭,打開(kāi)胸腔取出心臟,濾掉心內(nèi)殘存血液,生理鹽水沖洗干凈,切取心尖右心室壁部分放入-80℃冰箱中,用于mRNA研究及其他心肌丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的測(cè)定。其中,所取1 m l血于肝素抗凝管,3 000 r/min×5min離心分離血漿,置-18℃保存用于血漿指標(biāo)的測(cè)定,取0.5m l置于EDTA抗凝管,立即送第二軍醫(yī)大學(xué)用于常規(guī)生化指標(biāo)的測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)度訓(xùn)練模型建立的指標(biāo)體系

2.1.1 11周跑臺(tái)訓(xùn)練結(jié)束后,在末次訓(xùn)練的36 h采血測(cè)定HB、血漿睪酮、皮質(zhì)醇等血液指標(biāo)作為此次建模的指標(biāo)體系,通過(guò)比較對(duì)照組與訓(xùn)練組的這些指標(biāo)的顯著性變化來(lái)驗(yàn)證大鼠過(guò)度訓(xùn)練模型的建立是否成功(表3)。

表3 本研究過(guò)度訓(xùn)練建模后36 h訓(xùn)練大鼠血漿中血紅蛋白、皮質(zhì)酮和睪酮的含量變化一覽表Table 3 The Changes of Hb,Cortisol, Testosterone in Blood Plasma after 36h Training

2.1.2 11周跑臺(tái)遞增負(fù)荷訓(xùn)練過(guò)程中大鼠體重的變化

在訓(xùn)練的11周和訓(xùn)練后恢復(fù)的1周中,我們對(duì)對(duì)照組與單純訓(xùn)練組大鼠體重的變化進(jìn)行跟蹤測(cè)定(圖1)。

從圖1可看出,安靜訓(xùn)練組12周的建模過(guò)程中,大鼠體重均呈現(xiàn)規(guī)律的增長(zhǎng)趨勢(shì),前5周安靜對(duì)照組與單純訓(xùn)練組的大鼠體重基本無(wú)差異均呈現(xiàn)一定的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),但進(jìn)入第5周至第8周前訓(xùn)練組因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)負(fù)荷的加大,大鼠體重顯著增長(zhǎng)程度降低,而且在進(jìn)入第8周至11周這個(gè)負(fù)荷明顯加大的過(guò)度訓(xùn)練期,訓(xùn)練組大鼠的體重未增反降,在建模后1周的恢復(fù)期有所恢復(fù),但與同期安靜組對(duì)比,訓(xùn)練組大鼠的體重顯著低于安靜對(duì)照組。

圖1 本研究11周跑臺(tái)訓(xùn)練過(guò)程中與1周恢復(fù)后大鼠體重的變化曲線圖Figure. The Weight of Rat during Overtraining and after 7days Recovery

2.2 過(guò)度運(yùn)動(dòng)后血漿心肌損傷指標(biāo)的變化

過(guò)度運(yùn)動(dòng)建模后末次訓(xùn)練的36 h與7天時(shí)測(cè)定各組大鼠的血漿的心肌cTn I(圖2)和CK-MB的變化(圖3)。

圖2顯示,過(guò)度運(yùn)動(dòng)后36 h,同安靜對(duì)照C組比較,單純過(guò)度E組、DPI干預(yù)D組、谷氨酰胺干預(yù)G組及DPI合并谷氨酰胺干預(yù)DG組的大鼠血漿心肌cTn I的濃度均有不同程度增加,其中,E組增加幅度最大,D組與G組次之,但3組均達(dá)到非常顯著性差異水平,而DG組的血漿中cTn I的增加幅度明顯低于其他組;通過(guò)7天的恢復(fù),大鼠血漿心肌cTn I的濃度各組均有程度不同的下降,但單純訓(xùn)練E組、D組與安靜組比較仍有非常顯著性水平,G組達(dá)到顯著性水平,DG組下降幅度最大與對(duì)照組無(wú)顯著性差異;而干預(yù)組與單純訓(xùn)練組E比較,無(wú)論是DPI組、Gln組還是合并干預(yù)組DG的大鼠血漿cTn I的濃度均顯著低于訓(xùn)練組水平。36 h與恢復(fù)7天各組內(nèi)比較,通過(guò)7天恢復(fù)后,各組血漿中cTn I的濃度相應(yīng)的都有所下降,但E組、G組與DG組均達(dá)到顯著性水平,而D組下降未達(dá)到顯著性水平。

圖2 本研究各組大鼠在過(guò)度訓(xùn)練后36 h與恢復(fù)1周后血漿cTn I比較示意圖Figure 2. The Concertation of cTn I Rat Blood Plasma after Overtraining

圖3 本研究各組大鼠在過(guò)度訓(xùn)練后36 h與恢復(fù)1周后血漿CK-MB濃度的變化比較示意圖Fogire 3 The Concertation of CK-MB in Rat Blood Plasma after Overtraining

圖3顯示,過(guò)度運(yùn)動(dòng)后36 h,同安靜對(duì)照C組比較,單純過(guò)度E組、DPI干預(yù)D組、谷氨酰胺干預(yù)G組及DPI合并谷氨酰胺干預(yù)DG組的大鼠血漿CK-MB的濃度也有不同程度增加,其中,E組、D組與G組的增加都達(dá)到顯著性水平,DG組隨有所增加但未達(dá)到顯著性水平;而干預(yù)組與單純訓(xùn)練組E比較,合并干預(yù)組DG的血漿CK-MB的濃度顯著低于單純訓(xùn)練組;7天恢復(fù)后與安靜對(duì)照組比較,只有E組的血漿CK-MB水平仍然較高達(dá)到非常顯著性水平,D組與G組則達(dá)到顯著性水平,DG組則基本恢復(fù)安靜時(shí)水平。各組恢復(fù)7天時(shí)與36 h的血漿CK-MB水平比較發(fā)現(xiàn),D組與G組恢復(fù)程度較大達(dá)到顯著性水平,E組與DG組的恢復(fù)則隨有所下降但未達(dá)到顯著性水平。

2.3 過(guò)度運(yùn)動(dòng)后心肌組織中脂質(zhì)過(guò)氧化水平的變化

圖4 本研究各組大鼠在過(guò)度訓(xùn)練后36 h與恢復(fù)1周后心肌MDA水平的變化示意圖Figure 4 The Concertration of MDA in Rat Cardiac Muscle after Overtraining

圖4表示,同安靜組對(duì)照組比較,單純運(yùn)動(dòng)組在過(guò)度訓(xùn)練后36 h大鼠心肌MDA水平急劇上升達(dá)到了及其顯著性水平,D組與G組在運(yùn)動(dòng)后36 h隨有所升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,DG組則有所下降也未達(dá)到顯著性水平;而干預(yù)組與單純訓(xùn)練組E比較,無(wú)論是DPI組、Gln組還是合并干預(yù)組的心肌MDA的濃度均程度不一的低于單純訓(xùn)練組?；謴?fù)7天后與36 h的心肌MDA對(duì)照均有程度不一的恢復(fù)下降,但只有訓(xùn)練組達(dá)到非常顯著性水平。

2.4 過(guò)度運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞NADPH氧化酶的亞基gp91-phox和p22-phox的mRNA表達(dá)

為了更進(jìn)一步對(duì)過(guò)度運(yùn)動(dòng)心肌細(xì)胞所引起的運(yùn)動(dòng)損傷機(jī)制的探討,我們應(yīng)用了實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),對(duì)過(guò)度運(yùn)動(dòng)后影響ROS產(chǎn)生的NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基gp91-phox和p22-Phox的mRNA的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量測(cè)定。

通過(guò)對(duì)大鼠過(guò)度訓(xùn)練后36h的心肌細(xì)胞NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基gp91-phox和p22-phox的mRNA的表達(dá)的實(shí)時(shí)定量測(cè)定結(jié)果表明(圖5、圖6):過(guò)度運(yùn)動(dòng)后E組的gp91-phox和p22-phox的mRNA表達(dá)均上調(diào)并達(dá)到了非常顯著性水平,其他各組均的gp91-phox和p22-phox的mRNA表達(dá)的上調(diào)均未達(dá)到顯著性變化,而與單純訓(xùn)練組比較,則DPI干預(yù)組與合并干預(yù)組gp91-phox和p22-phox的mRNA表達(dá)均顯著性下調(diào),谷氨酰胺組的gp91-phox的mRNA表達(dá)也顯著下調(diào),但p22-phox的mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化。

3 分析與討論

3.1 過(guò)度訓(xùn)練模型的指標(biāo)體系成功建立

過(guò)度運(yùn)動(dòng)模型的建立是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之處,本實(shí)驗(yàn)在參考過(guò)度運(yùn)動(dòng)模型建立的基礎(chǔ)上,延長(zhǎng)最后一周的訓(xùn)練時(shí)間為大鼠力竭,參考文獻(xiàn)[23]以大鼠體重、一般情況、運(yùn)動(dòng)能力等進(jìn)行過(guò)度的監(jiān)測(cè),輔以血漿皮質(zhì)酮和睪酮以及血紅蛋白等指標(biāo)建立這樣的指標(biāo)體系協(xié)助判斷動(dòng)物過(guò)度模型的成功建立。該實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)體系表明:訓(xùn)練組與安靜對(duì)照組的皮質(zhì)酮、睪酮、血紅蛋白及體重的變化顯著性差異中確認(rèn)本次過(guò)度實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒ⅰ?/p>

圖5 本研究過(guò)度訓(xùn)練后各組大鼠心肌NADPH氧化酶gp91-phox的m RNA表達(dá)變化示意圖Figure 5 The Expression of gp91-phox mRNA in Rat Cardiac Muscle after Overtaining

圖6 本研究過(guò)度訓(xùn)練后各組大鼠心肌NADPH氧化酶p22-phox的m RNA表達(dá)變化示意圖Figure 6 The Expression of p22-phox mRNA in Rat Cardiac Muscle afterOvertaining

3.2 心肌損傷的程度與機(jī)體過(guò)氧化程度的的量化

肌酸激酶同工酶(CK-MB)是由M和B亞基構(gòu)成的雜化型二聚體,主要存在于心肌細(xì)胞的外漿層,是心肌酶譜中的特異性酶,一度被認(rèn)為是診斷心肌損傷特別是急性心肌梗死(AM I)的“金標(biāo)準(zhǔn)”而廣泛應(yīng)用,CK-MB在心肌損傷30h達(dá)到高峰,本研究在建模末次訓(xùn)練的36～40 h內(nèi)取樣能較好地體現(xiàn)過(guò)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌損傷的最高程度,且該酶的出現(xiàn)時(shí)間較傳統(tǒng)酶學(xué)指標(biāo)要早,特異性和敏感度也相對(duì)要高,但CK-MB作為心肌損傷檢測(cè)的標(biāo)志酶,尚有不足之處。當(dāng)心肌缺血或發(fā)生微小梗死時(shí),CK-MB常不增高,由此可見(jiàn),CK-MB對(duì)于心肌微小損傷不能檢出[7]。心肌肌鈣蛋白(cTn)在心肌細(xì)胞有微小損傷時(shí),cTn就有明顯升高,因此,可用于微小心肌損傷(MMD)的診斷,使其成為一種新的診斷心肌缺血壞死的血漿學(xué)指標(biāo),而其在血漿中出現(xiàn)早,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),是一種高特異、高靈敏度的反映心肌損傷的血漿蛋白質(zhì),在心肌細(xì)胞完整狀態(tài)下,cTn I約3%游離在血漿內(nèi),其余同心肌結(jié)構(gòu)蛋白相結(jié)合,當(dāng)心肌損傷時(shí),游離于胞漿中的cTn I快速釋放入外周血循環(huán),血漿水平于3～5 h升高,其后肌原纖維不斷崩解破壞,cT-n I不斷釋放,cTn I血漿水平在24 h達(dá)到峰值,4～10天恢復(fù)到正常水平[3]。發(fā)生心肌梗死病人在發(fā)病后2～4 h后血液中cTn I和中cTnT出現(xiàn)升高現(xiàn)象并持續(xù)到21d[18]。目前,關(guān)于運(yùn)動(dòng)尤其是大強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)可引起血液中cTn I和中cTnT升高的報(bào)道很多,但不管是人體或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果都顯示:運(yùn)動(dòng)后血液中cTn I和中cTnT升高的現(xiàn)象在運(yùn)動(dòng)后24～48 h后消失[24]。因此,本實(shí)驗(yàn)在大鼠過(guò)度訓(xùn)練后7天的血漿cTn I的濃度仍沒(méi)有恢復(fù)到訓(xùn)練前水平值得深思。Hesse在研究報(bào)告稱(chēng),只有在心肌不可逆損傷的初期,由于心肌代謝功能的抑制而引起心肌cTn I的釋放的下調(diào),而一旦進(jìn)入不可逆損傷期,肌原纖維崩解破壞心肌釋放cTn I大幅增加,恢復(fù)時(shí)間就會(huì)延長(zhǎng)[13]。據(jù)此推測(cè),本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠過(guò)度訓(xùn)練模型是在過(guò)度訓(xùn)練的基礎(chǔ)上再合并力竭訓(xùn)練,該模型運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的時(shí)間短,運(yùn)動(dòng)頻率高,運(yùn)動(dòng)負(fù)荷過(guò)大是否對(duì)大鼠心肌的損傷有可能是一種不可逆損傷?由于目前對(duì)于運(yùn)動(dòng)引起的可逆性損傷與不可逆損傷的臨界血液學(xué)指標(biāo)的濃度還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道,其損傷的程度和運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度以及時(shí)間及負(fù)荷的依從關(guān)系有待通過(guò)反映心肌損傷的血液指標(biāo)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的合并應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

心肌MDA是反映心肌細(xì)胞總體脂質(zhì)過(guò)氧化的水平,是心肌細(xì)胞在過(guò)度運(yùn)動(dòng)的誘導(dǎo)下多種途徑產(chǎn)生ROS的終極代謝產(chǎn)物,而機(jī)體異常ROS的表達(dá)可與心肌細(xì)胞成分,如膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),造成心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能性代謝障礙。已有研究表明,ROS與心肌缺血與壞死、心肌頓抑、心功能衰竭等密切相關(guān)[8,10,19]。本實(shí)驗(yàn)單純訓(xùn)練組在過(guò)度訓(xùn)練后36h心肌MDA水平急劇上升,表現(xiàn)出與CK-MB與cTn I的變化與MDA變化一定的相關(guān)性,說(shuō)明過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起心肌細(xì)胞的過(guò)氧化而導(dǎo)致心肌損傷。但7d后心肌MDA的水平有低于訓(xùn)練前的趨勢(shì),其原因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的一種適應(yīng),與此前有關(guān)此方面的報(bào)道一致[22]。

3.3 DPI與Gln對(duì)過(guò)度訓(xùn)練心肌損傷的協(xié)同干預(yù)作用

運(yùn)動(dòng)時(shí)ROS產(chǎn)生的增加導(dǎo)致心肌的過(guò)氧化損傷已經(jīng)是一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)。但心肌活性氧的產(chǎn)生途徑眾多,其中,NADPH氧化酶途徑是心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS的途徑之一,NADPH氧化酶是細(xì)胞線粒體呼吸過(guò)程中催化NADPH遞氫離子給氧的還原性酶,NADPY氧化酶及其家族NOX是公認(rèn)的能夠調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生的特殊功能酶。目前已被發(fā)現(xiàn)在包括有吞噬細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞等多個(gè)組織細(xì)胞中有表達(dá),由其介導(dǎo)產(chǎn)生的適度的ROS現(xiàn)已證明不再是有氧代謝的副產(chǎn)物,而是具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫功能、激素生物合成功能的活性產(chǎn)物,但過(guò)多的ROS的產(chǎn)生可以導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生而是細(xì)胞DNA交聯(lián)斷裂,細(xì)胞凋亡性細(xì)胞損傷。有研究證實(shí),在心肌肥大和心衰病人中,心肌的NADPH氧化酶的表達(dá)和活性升高[15]。那么,運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌ROS的活性氧的產(chǎn)生是否與運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致NADPH氧化酶的激活關(guān)聯(lián)呢?如果關(guān)聯(lián),該路徑ROS產(chǎn)生的抑制不妨為降低心肌氧化損傷的有效措施。Engberding等[8](2004)的研究就是針對(duì)心梗時(shí)黃嘌呤ROS產(chǎn)生途徑的黃嘌呤氧化酶(XO)表達(dá)顯著增多,而聯(lián)用XO阻滯劑與別嘌呤醇減少心肌ROS的產(chǎn)生,適應(yīng)于左室重建,從而改善心梗后心功能。因此,對(duì)于NADPH氧化酶的抑制劑DPI的使用也是基于此方面的思考。同時(shí),Gln是一種非必需氨基酸,參與體內(nèi)許多重要的代謝過(guò)程,是一種重要的氮源運(yùn)載工具,也是體內(nèi)多種細(xì)胞的重要能源來(lái)源之一。近年來(lái),補(bǔ)充Gln在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中和臨床研究表明:缺血再灌注損傷由于氧自由基大量增加,攻擊細(xì)胞膜致其脂質(zhì)過(guò)氧化,細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)受損,引起細(xì)胞代謝及功能障礙,甚至導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死[2,9]。因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用了DPI與Gln兩種干預(yù)措施的單個(gè)和合并的應(yīng)用,其中, DPI是NADPH氧化酶的特異性抑制劑,抑制NADPH遞氫給氧氣產(chǎn)生ROS,因此,從ROS的產(chǎn)生途徑來(lái)抑制該酶的活性從而降低活性氧的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,DPI干預(yù)組與Gln干預(yù)組均可降低過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起的心肌的CKMB與cTnl的水平,從而降低心肌的氧化損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分明顯地表示:DPI干預(yù)組與Gln干預(yù)的合并干預(yù)并無(wú)拮抗作用,而可顯著降低血漿cTn I的水平而有效地降低運(yùn)動(dòng)引起的心肌微小損傷。

3.4 過(guò)度運(yùn)動(dòng)使心肌細(xì)胞NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的基因表達(dá)上調(diào)而激活NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS

為了更進(jìn)一步確定運(yùn)動(dòng)對(duì)NADPH氧化酶活性的影響,驗(yàn)證過(guò)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌過(guò)氧化損傷是由于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生ROS途徑所致,本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定過(guò)度運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞的亞基gp91-phox和p22-phox的mRNA表達(dá)。分別與安靜組與單純訓(xùn)練組比較的結(jié)果表明,DPI可顯著抑制NADPH氧化酶的活性,Gln的干預(yù)對(duì)NADPH氧化酶的活性有微弱影響,其機(jī)制尚不確定,但DPI與Gln兩者合并使用并沒(méi)有拮抗抑制NADPH氧化酶活性,干預(yù)組和合并干預(yù)組各組NADPH氧化酶的活性與定量心肌損傷指標(biāo)以及脂質(zhì)過(guò)氧化水平各組的變化基本關(guān)聯(lián),而且,表現(xiàn)出DPI與Gln合并使用協(xié)同抗氧化的能力。其原因在于,一方面,DPI抑制了NADPH氧化酶的活性;另一方面,Gln作為還原型谷胱苷肽的前體物質(zhì)與合成嘌呤和嘧啶堿的能源物質(zhì)形成強(qiáng)抗氧化作用。

4 小結(jié)

過(guò)度運(yùn)動(dòng)可引起心肌細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的mRAN基因表達(dá)上調(diào)從而激活NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生ROS,導(dǎo)致心肌ROS的產(chǎn)生增加,使心肌產(chǎn)生過(guò)氧化脅迫狀態(tài)而導(dǎo)致心肌損傷。所以,可以肯定的是,運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生ROS是心肌過(guò)氧化損傷的途徑之一,因此,在此途徑上對(duì)NADPH氧化酶抑制劑DPI的使用可以有效地抑制NADPH氧化酶的活性從而降低ROS的產(chǎn)生。Gln單一的使用可干預(yù)心肌缺血性氧自由基增多,也具有抗氧化保護(hù)心肌損傷的作用,兩者合并使用并無(wú)功能上的拮抗作用,而是具有協(xié)同的抗氧化防護(hù)作用,所以,NADPH氧化劑的使用與谷氨酰胺的合并使用可從ROS的產(chǎn)生途徑和抗氧化劑的能量供應(yīng)兩方面來(lái)有效降低運(yùn)動(dòng)引起的心肌過(guò)氧化損傷。

[1]金其貫,馮美云.谷氨酰胺和精氨酸對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制干預(yù)作用的研究[J].北京體育大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(8):1075-1078.

[2]戚仁斌,熊怡,陸大祥,等,甘氨酰谷氨酰胺在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)病理生理雜志, 2009,25(5):853-858.

[3]ADAMSJ E,BODOR GS,DAV ILA-ROMAN V G,et al.Cardiac troponin I,A marker w ith high specificity for cardiac injury [J].Circulation,1993,88:101-106.

[4]ASCENSAO A,MAGALHAESJ,SOARESJ,et al.Endurance training attenuatesdoxorubicin induced cardiac oxidative damage in mice[J].Int J Cardiol,2005,28(3):451-60.

[5]BOLOTIN G,RAMAN J,W ILL IAMS U,et al.Glutamine imp rovesmyocardial function following ischemia-reperfusion injury [J].A sian Cardiovasc Tho rac Ann,2007,15:463-467.

[6]CHRISTOPHE H,JENN IFER K B,Philippe R,et al.Increased myocardial NADPH-oxidase activity in human heart failure[J]. J Am Coll Cardiol,2003,40(12):2164-2171.

[7]COLL INSON PO,STUBBS PJ,KESSLER AC,et al.M ulticentre evaluation of the diagnostic value of cardiac troponin-T,CKMB mass,andmyoglobin for assessing patientswith suspected acute co ronary syndromes in routine clinical p ractice[J].Heart, 2003,89(3):280-286.

[8]ENGBERD ING N,SPIEKERMANN S,SCHAEFER A,et al. All opurinol attenuates left vent recular remodeling and dysfunction after experimental myocardial infarction:a new action for an old drug[J].Circulation,2004,(110):2175-2179.

[9]GARCIA-GIL FA,GONZALVO E,GARCIA-GARCIA J,et al. Lipid peroxidation in ischemia-reperfusion oxidative injury of the graft p reserved in Celsior and University of Wisconsin solutions on a pig pancreas transplantation model[J].Transp Lant Proc, 2006,38(8):2595-2599.

[10]GIORDANO F J.Oxygen,oxidative stress,hypoxia,and heart failure[J].J Clin Invest,2005,(115):500-508.

[11]GIOVAN ISC,JERRIL R,ALVARO RO.Overtraining:theories,diagnosis and markers[J].Rev Bras Med Esport,2006,12 (5):134-145.

[12]HELM Y M,SIRAG Y,HUANGJ Q.Renal(p ro)renin receptor up-regulation in diabetic rats through enhanced angiotensin A T1 receptor and NADPH oxidase activity[J].Exp Physiol 2008,93(5):709-714.

[13]HESSEL M H M,M ICH IELSEN EC H J,A TSMA D E,et al. Release kinetics of intact and degraded troponin Iand T after irreversible cell damage[J].Exp Mol Pathol,2008,(85):90-95.

[14]HOHL R,FERRARESSO R L,DEOL IVEIRA R B.Development and characterization of an overtraining animalmodel[J]. Med Sci Sports Exe,2009,41(5):1155-1163.

[15]JIAN M L,N ICK P G,DAV ID J G,et al.Activation of NADPH oxidase during p rogression of cardiac hypertrophy to failure [J].Hypertension,2002,40(4):477-484.

[16]GRIENDL ING K K.NADPH Oxidases:New regulato rs of old functions[J].Antioxid Redox Sign,2006,8(9-10):1443-1445.

[17]KOLLER,SCHOBERSBERGER W.Post-exercise release of cardiac troponins[J].J Am Col Cardiol,2009,53(15):1341-1341.

[18]KWON S H,PIM EN TEL D R,REMOND INO A,et al.H2O2 regulates cardiac myocyte phenotype via concent ration-dependent activation of distinct kinase pathways[J].JMol Cell Cardiol,2003,(35):615-621.

[19]LASLETT L,EISENBUD E,L IND R.Evidence of myocardial injury during p rolonged strenuous exercise[J].Am J Cardiol, 1996,78(4):488-490.

[20]L IN W T,YANG S C,TSA I S C.L-A rginine attenuates xanthine oxidase and myeloperoxidase activities in hearts of rats during exhaustive exercise[J].Brit J Nutr,2006,95(4):67-75.

[21]MCKENZIE E C,JOSEC E.Serum chemistry alterations in A-laskan sled dogs during five successive daysof p rolonged endurance exercise[J].J Am Vet Med Assoc,2007,23(10):1486-1492.

[22]M EEUSEN R,PIACEN TIN IM F,BUSSCHAERT B,et al. Ho rmonal responses in athletes:the use of a two bout exercise p rotocol to detect subtle differences in(over)training status [J].Eur J App l Physiol,2004,91(2):140-146.

[23]ZOPPI C C,MACEDO D V.Overreaching-induced oxidative stress,enhanced HSP72 exp ression,antioxidant and oxidative enzymes dow n regulation[J].Scand J Med Sci Spo rts,2008,18 (2):67-76.

[24]SCHARHAGJ,GEORGE K,SHAVER,et al.Exercise-associated increases in cardiac biomarkers[J].Med Sci Sports Exe, 2008,40:1408-1415.

The Oxidative Damage and in Rat M yocardial Cells Induced by Exhaustive Exercise and the Intervention of DPIand Glutam inate

DONG Jing-mei1,2,CHEN Pei-jie2,L IU Ju-ke1,YU Zhi-qi1

Objective:To exp lo re the pathways of reactive oxygen species(ROS)induced by exhaustive exercise that damage myocardial cell and to put anti-oxidant intervention into p ractice w ith the combination both the way of generating ROS and the nutrition.Methods:85 male Wistar rats were random ly divided into five groups and established p ro tocol of exhaustive exercise.The five groups is sedentary control group(C),exhaustive exercise group(E),exhaustive exercise and DPI intervention group(D),exhaustive exercise and glutamine intervention group(G),exhaustive exercise and the combination of DPI and glutamine intervention group (DG).The concentration ofmalondialdehyde(MDA),cardiac troponin T(c Tn T),creatine isoenzyme(CK-MB)in rat blood p lasma were determined at 36-40 hours after exhaustive exercise and 7 days recovery respectively.The exp ression of FAS/FASL of m RNA and the NADPH oxidase subunit gp91-phox p22-phox of m RNA in cardiac myocyte were detected w ith real-time quantitative PCR.Results:Compared w ith control group C,the concentration of MDA,c Tn I,CK-MB in E group were increased significantly after 7 days recovery were decreased significantly and the concentration in group D and group G also increased no significantly and in DG group did no t change.The exp ression of the FAS/FASL,gp91-phox,p22-Phox of m RNA also showed the same results as the plasma index in all groups at 36h after exercise.Conclusion:The exhaustive training can cause excessive oxidative damage in the heart muscle.The one pathway of ROS generated by NADPH oxidase is the one reasons of the peroxide injury of myocardial cell.So the combination intervention w ith the inhibitors of NADPH oxidase and glutamine supplement can p rotect the oxidative injury in myocardial cell induced by exhaustive exercise effectively.

rat;exhaustive exercise;NAD PH oxidase;reactive oxygen species;m yocardial cells;oxidative injury;FAS/FASL;D PI;glutam ine

G804.7

A

2010-07-05;

2010-11-10

甘肅省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(0803RJZA 083)。

董靜梅(1969-),女,甘肅慶陽(yáng)人,副教授,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)學(xué),Tel:(021) 35080378,E-mail:Lzdjm119@sohu.com。

1.蘭州城市學(xué)院體育學(xué)院,甘肅蘭州730070;2.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院,上海200438 1.Lanzhou City University,Lanzhou 730070,China; 2.Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

1.3 血漿指標(biāo)及心肌組織中丙二醛的測(cè)定

血漿指標(biāo)包括皮質(zhì)酮和睪酮及心肌肌鈣蛋白(c Tn I)、肌酸同工酶(CK-MB)以及心肌組織中的丙二醛(MDA)均采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定,其中,MDA試劑盒由南京建成生物制品研究所提供外,其他EL ISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.4 NADPH氧化酶亞基gp91-phox和p22-phox的mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)定量測(cè)定

1.4.1 心肌總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成

取凍存心肌組織置于玻璃勻漿器中,加入1 ml Trizol液勻漿充分,按照TRIzol RNA提取試劑盒操作說(shuō)明(GIBCO BRL公司)要求的順序和劑量加入反應(yīng)物,在吸光度為260 nm紫外分光光度計(jì)(Unico UV-2000型)測(cè)定RNA濃度后加入2 ugRNA在20μl反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI公司)于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

序列參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中各目的基因的序列,引物由ABI公司的Primer Exp ress Software v2.0設(shè)計(jì),由Invitrigen公司合成gp91-phox、p22-phox以及內(nèi)參GAPDH的序列位置(表2)。

PCR擴(kuò)增:25μL體系:其中,10×PCR Buffer 2.5μl,滅菌蒸餾水15.1μl,TaKaRa 2μl,Taq HS 0.3μl,上下游引物各0.3μl,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl,sybr染料0.5μl.反應(yīng)條件是:(95℃2 min)1 cycle;(94℃10 s,61℃10 s,72℃40s)40 cycles.61℃退火。定量PCR檢測(cè)在Rotor-Gene RG 3000型(Corbett,Aust ralia)PCR儀上進(jìn)行。結(jié)果用絕對(duì)定量的基因表達(dá)的拷貝數(shù)表示,并用GAPDH對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。

表2 本研究gp91-phox、p22-phox與GAPDH的基因序列及PCR引物設(shè)計(jì)一覽表
Table 2 The Forward of gp91-phox、p22-phox and GAPDH

Primer Sequence(5’-3’)Sequence Number gp91phox Forward Reverse TGACTTGGAAA TGGA TCGTGG CGCCAACAA TGCGGA TA TGTG AJ295950.1 p22-phox Forward Reverse TTGCAGGAGTGCTCA TCTGTC GTTGGTAGGTGGCTGCTTGA T NM_024160.1 GAPDH Forward Reverse ACCACAGTCCA TGCCA TCAC TCCACCACCCTGTTGCTGTA NM_017008

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

所有測(cè)試結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±SD),用SPSS for Window s 13.0軟件分析處理,進(jìn)行單因素方差分析(One-way AVOVA),P<0.05為具有顯著性意義,P< 0.01為具有非常顯著性意義。

1000-677X(2010)12-0076-06