盧 琪,曹少謙,呂思伊,周 熒,高 麗,潘思軼*
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)
綠原酸酵母細(xì)胞微膠囊工藝研究
盧 琪,曹少謙,呂思伊,周 熒,高 麗,潘思軼*
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)
采用釀酒酵母的細(xì)胞壁包埋水溶性的綠原酸,通過正交試驗(yàn)考察包埋溫度、包埋時(shí)間、芯材比和加水量因素對(duì)綠原酸微膠囊包埋率的影響。結(jié)果表明,在包埋溫度40℃、包埋時(shí)間6h、芯材比3:1(g/g),以6mL蒸餾水為包埋介質(zhì)的組合條件下,包埋率最大為18.9%。微膠囊紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)綠原酸的特征官能團(tuán)的振動(dòng)消失;熒光顯微鏡觀察顯示微膠囊呈球形,微膠囊內(nèi)的綠原酸自發(fā)明亮的熒光;高效液相色譜定性分析顯示,綠原酸包埋前后保留時(shí)間及紫外掃描圖譜相一致。研究結(jié)果表明綠原酸成功的包埋到酵母細(xì)胞壁內(nèi),且在包埋過程中沒有發(fā)生任何化學(xué)變化。
綠原酸;細(xì)胞壁;微膠囊;正交試驗(yàn);高效液相色譜
Abstract :Brewer's yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells subjected to a 24 h plasmolysis treatment were used to encapsulate chlorogenic acid, a water-soluble antioxidant. The optimal encapsulation for 6 h at 40 ℃ and 3:1 core material/wall material ratio(g/g) in 6 mL of distilled water as encapsulation medium determined using orthogonal array design resulted in a maximum encapsulation efficiency of 18.9%. Infrared spectral analysis indicated the disappearance of characteristic function groups of chlorogenic acid. Fluorescence microscopic studies revealed that the microcapsules were spherical in shape and that the spontaneous fluorescence of chlorogenic acid was observed on the inner side of yeast cell wall. The similar retention time and UV-Vis profiles between unmicroencapsulated and microencapsulated chlorogenic acid were found through HPLC analysis. All these results suggested that chlorogenic acid was successfully encapsulated and no significant chemical changes occurred during the encapsulation process.
Key words:chlorogenic acid;microencapsulation;cell wall;orthogonal array design;HPLC
當(dāng)今,人們?cè)絹碓阶⒅赝ㄟ^功能性食品來預(yù)防、治療疾病[1]。綠原酸作為天然存在的酚類化合物,具有抗氧化功能,醫(yī)學(xué)上證實(shí)其具有利膽、降壓、抗菌、消炎及升高白細(xì)胞等藥理作用[2-4]。但在許多情況下,酚類物質(zhì)通常具有令人反感的味道和不穩(wěn)定的性質(zhì)。因此,如何利用食品工藝學(xué)方法處理綠原酸,既能充分發(fā)揮其療效,又能祛除異味、提高穩(wěn)定性,已成為一項(xiàng)具有探索性的研究課題[5-6]。
微膠囊技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。然而,這些技術(shù)主要應(yīng)用在包埋揮發(fā)性油和香料等酯溶性物質(zhì)中。包埋壁材通常選用具有兩親性結(jié)構(gòu)的物質(zhì),如環(huán)狀糊精和大豆蛋白,它們通過內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)包埋酯溶性的物質(zhì),提高其穩(wěn)定性,而關(guān)于包埋水溶性物質(zhì)的報(bào)道甚少。酵母細(xì)胞呈球形或橢球形,以分散的單細(xì)胞狀態(tài)存在,大小在幾微米到20微米范圍內(nèi),完整的酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有一定的強(qiáng)度和通透性,因此是理想的微膠囊壁材[7-8]。在包埋過程中無需引入其他的化學(xué)試劑,避免了藥物殘留,并且獲得的微膠囊產(chǎn)品大小均一、無毒、生物相溶性好、易生物降解[9]。
本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母細(xì)胞壁包埋綠原酸的工藝條件,并通過紅外光譜分析、熒光顯微鏡觀察和高效液相色譜分析來表征綠原酸微膠囊,旨在建立一種綠原酸微膠囊的制備新工藝。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
綠原酸(chlorogenic acid,CGA,純度90%) 泰安中薈植物生化有限公司。
2998高效液相色譜儀 美國Waters公司;Eclipse 80i熒光顯微鏡 日本Nikon公司;傅里葉變換紅外光譜美國 Nicolet公司;SHA-B 恒溫水浴振蕩器 常州國華電器有限公司;SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;Anke TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.3.1 包埋壁材的制備
采用YPD液體培養(yǎng)基(酵母提取物10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,溶于1L水),水浴振蕩培養(yǎng)酵母細(xì)胞(28℃,200r/min,36h)后,離心(4200r/min,10min)收集酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞經(jīng)5次水洗后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉溶液(體積為酵母細(xì)胞的4倍),置于錐形瓶,放入搖床進(jìn)行質(zhì)壁分離(54℃,150r/min,24h)。質(zhì)壁分離后的酵母細(xì)胞再次離心(4200r/min,10min),水洗5次后,冷凍干燥。
1.3.2 綠原酸微膠囊的制備
按不同的芯材比加入CGA和酵母細(xì)胞及一定體積的蒸餾水,在100mL的燒杯中混合攪拌,加蓋后放入搖床。恒溫恒速振蕩一定時(shí)間后,CGA可通過滲透擴(kuò)散作用進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)部,形成微膠囊?;旌弦涸?200 r/min下離心15min后緩慢倒出上層清液,下層細(xì)胞用蒸餾水洗滌,除去未包入的綠原酸,40℃真空干燥1h。
1.3.3 包埋率的計(jì)算
微膠囊中綠原酸包埋率的計(jì)算如下:
式中:Y為綠原酸包埋率/%;mA為加入的干酵母質(zhì)量/g;mB為收集的微膠囊總質(zhì)量/g。
1.3.4 熒光顯微鏡觀察微膠囊形態(tài)[10]
綠原酸酵母微膠囊被分散在雙蒸水中形成懸濁液后,烘干固定。在同一熒光強(qiáng)度,同一激發(fā)波長下,觀察酵母細(xì)胞壁所產(chǎn)生的熒光和酵母膠囊包埋的綠原酸發(fā)出的熒光。利用熒光顯微鏡獲得明場視野和熒光顯微鏡圖像,數(shù)字圖像處理使用Adobe Photoshop軟件。
1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析
將2mg的綠原酸樣品、凍干的酵母細(xì)胞和已包埋的微膠囊粉末碾磨均勻,使其分布在200mg的溴化鉀中利用壓片。壓片后放置在傅里葉變換紅外分光鏡中測定。
1.3.6 綠原酸微膠囊的釋放及成分分析
將0.1g綠原酸酵母膠囊,用50mL鹽酸(0.1mol/L)破壁萃取5次,綠原酸的定性分析由高效液相色譜儀測定。流動(dòng)相的成分的體積配比為水:甲醇:冰醋酸=700:300:2;流速為0.8mL/min;樣品上液量為20μL;檢測波長:326nm。此外,酵母包埋后的綠原酸紫外吸收波段在200~400nm之間確定[11]。
通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),研究了包埋時(shí)間(A)、加水量(B)、芯材比(C)和溫度(D)4個(gè)因素對(duì)酵母微膠囊制備的影響。其中芯材比是指綠原酸純品(囊心)質(zhì)量和酵母細(xì)胞壁(壁材)質(zhì)量的配比。結(jié)果如表1~3所示。
表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design
表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results of the encapsulation efficiency
表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of the encapsulation efficiency with various encapsulation conditions
正交試驗(yàn)方案及結(jié)果如表1~3所示。通過極差分析和方差分析結(jié)果可以看出:包埋芯材比對(duì)包埋效果影響最大,當(dāng)芯材比逐漸增大時(shí),體系中綠原酸的濃度增大,細(xì)胞外的滲透壓也隨之增大,加速了綠原酸向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散從而使包埋率增大。時(shí)間對(duì)包埋率的影響次之,足夠的時(shí)間能保證綠原酸充分的向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散。加水量間接影響了綠原酸的包埋濃度從而影響包埋率。溫度對(duì)包埋率的影響最小,隨著溫度的升高,分子運(yùn)動(dòng)加快,促進(jìn)了綠原酸的擴(kuò)散。但溫度過高可能破壞了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性或韌性,導(dǎo)致綠原酸溶出,影響包埋率。結(jié)果說明,極差分析的結(jié)果可信度很高(P < 0.0001)。
通過正交試驗(yàn)得出各因素的最佳水平組合為A2B2C3D2,即包埋溫度40℃、包埋時(shí)間6h、芯材比3:1(g/g),用6mL的蒸餾水溶解。對(duì)該最佳組合條件經(jīng)過3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),獲得的微膠囊包埋率平均結(jié)果是18.9%,略高于正交試驗(yàn)最大值15.6% (5號(hào)試驗(yàn)結(jié)果)。微膠囊中綠原酸包埋率可達(dá)18.9%,比環(huán)狀糊精包埋酯溶性物質(zhì)所得的包埋率要低,這可能是由于綠原酸粉末包埋過程中需先溶解再真空干燥成固體的原因,本實(shí)驗(yàn)采用搖床振蕩使綠原酸擴(kuò)散包埋的方法優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的加壓包埋的方法,其包埋率為12.6%[12]。
圖1 普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下的酵母細(xì)胞(A, B)和微膠囊(C, D)Fig.1 Optical microscopic observations: A. yeast cells; and C.chlorogenic acid microcapsules. Fluorescence microscopic observations: B. yeast cells; and D. chlorogenic acid microcapsules
光學(xué)顯微鏡下(圖1A)酵母細(xì)胞呈圓形,有厚厚的細(xì)胞壁包圍。光學(xué)顯微鏡下的微膠囊的形態(tài)(圖1C),與酵母細(xì)胞的圖片并無明顯區(qū)別。由光顯微鏡下的酵母細(xì)胞圖像(圖1B)可看見細(xì)胞壁在330~380nm紫外激發(fā)波長下,帶有微弱的藍(lán)色熒光。而熒光顯微鏡下的微膠囊圖像(圖1D)中酵母細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生明顯熒光,其熒光強(qiáng)度和色澤較圖B強(qiáng)。由于綠原酸除了自身結(jié)構(gòu)特征能夠自發(fā)熒光,相關(guān)研究表明綠原酸和酵母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多糖之間的相互作用,包括共價(jià)鍵作用和非共價(jià)鍵作用,如氫鍵、疏水鍵、離子鍵、π鍵等,也能發(fā)出熒光,可以推斷微囊狀熒光是綠原酸包埋后發(fā)出的[13-14]。制片時(shí)雖然使微膠囊被分散在雙蒸水中形成懸濁液,但細(xì)胞附近并無相應(yīng)的熒光,這說明,酵母細(xì)胞與綠原酸之間產(chǎn)生相互作用,酵母細(xì)胞能夠有效的阻止綠原酸的釋放和容出。圖1A和圖1C是在光學(xué)顯微鏡明場條件下圖片底色為灰色或淡藍(lán)色,而圖1B和圖1D是在熒光環(huán)境下,圖片底色為黑色,有助于觀察熒光的強(qiáng)度和色澤。
圖2 綠原酸、酵母細(xì)胞、微膠囊的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of chlorogenic acid, yeast cells and chlorogenic acid microcapsules
綠原酸、酵母細(xì)胞和微膠囊的紅外光譜圖,如圖2所示。根據(jù)CGA純品的紅外光譜分析,從特征吸收波數(shù)可知,3390cm-1為O-H的伸縮振動(dòng);在1632cm-1有一特征峰,為單核芳香烴C=C伸縮振動(dòng),1521cm-1附近出現(xiàn)C=O非伸縮振動(dòng),認(rèn)為是-COO基團(tuán);波數(shù)在1389cm-1附近的吸收峰為甲基的面內(nèi)彎曲振動(dòng);在1270、1115cm-1和1062cm-1的吸收峰,可能為C-OC反對(duì)稱伸縮振動(dòng);在 819cm-1處有一吸收峰,可能是由R-CH=CH2面外彎曲振動(dòng)引起的;在 607cm-1處有一特征峰可能為對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)引起的,也可能有C=O面內(nèi)彎曲振動(dòng)結(jié)構(gòu)[15]。而從微膠囊的紅外光譜可知,在607、819、1389cm-1處的CGA原有的特征峰消失。因此,可考慮以下可能性,如綠原酸,蛋白質(zhì)和多糖之間相互作用,微膠囊和酵母細(xì)胞之間形狀和強(qiáng)度的改變使得微膠囊中的綠原酸在 607、819、1389cm-1處的吸收峰消失,這些情況間接表明綠原酸被包埋到了酵母細(xì)胞中。
圖3 綠原酸純品和酵母微膠囊化的綠原酸色譜(a)和光譜(b)圖形的對(duì)比Fig.3 HPLC chromatograms (a) and UV spectra (b) of chlorogenic acid standard and chlorogenic acid microcapsules
圖3a是綠原酸純品和酵母細(xì)胞微膠囊化的綠原酸在HPLC中的色譜圖,在同一色譜條件下綠原酸純品和酵母細(xì)胞微膠囊化的綠原酸有同樣的出峰時(shí)間,而且通過PDA檢測器檢測兩者在其他波長下沒有雜峰。圖3b是綠原酸純品和酵母細(xì)胞微膠囊化的綠原酸在HPLC中的光譜圖,綠原酸純品和酵母細(xì)胞微膠囊化的綠原酸具有相同的峰形,兩者的最大吸收均在326nm,最小吸收均在264nm和肩峰均在299nm。這些都證明了兩者是相同的物質(zhì)。
圖中同樣的色譜出峰時(shí)間和相同的UV-Vis圖譜表明,在包埋過程中綠原酸沒有發(fā)生任何化學(xué)變化。
3.1 優(yōu)化的微膠囊制備條件:包埋溫度40℃、包埋時(shí)間6h、芯材比3:1(g/g),用6mL的蒸餾水溶解。對(duì)最佳組合條件經(jīng)過3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),獲得的微膠囊包埋率平均結(jié)果是18.9%。
3.2 通過熒光顯微鏡分析,質(zhì)壁分離的酵母細(xì)胞呈球形,大小均一,在熒光顯微鏡下發(fā)出淡藍(lán)色的熒光。包埋后的綠原酸由于綠原酸自身結(jié)構(gòu)特征,及與酵母細(xì)胞的相互作用形成氫鍵、π鍵等,發(fā)出顏色較亮的熒光,圖中只有酵母細(xì)胞存在的地方才出現(xiàn)熒光,說明綠原酸被充分的包埋進(jìn)入酵母細(xì)胞,外部無殘留。
3.3 紅外圖譜分析,包埋后的綠原酸在607、819、1389cm-1處的吸收峰消失,證明綠原酸被包埋到酵母細(xì)胞內(nèi),外部無殘留。
3.4 通過高效液相色譜的定性分析,包埋前后綠原酸的保留時(shí)間均在6min左右(兩者差值小于2%),并且PDA檢測器檢測兩者在其他波段沒有吸收峰出現(xiàn),說明綠原酸在包埋前后沒有發(fā)生任何化學(xué)變化。同時(shí),綠原酸包埋前后的紫外吸收?qǐng)D譜一樣,進(jìn)一步證明用酵母細(xì)胞包埋前后的綠原酸為同一物質(zhì)。
3.5 實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該注意到綠原酸本身的不穩(wěn)定性,包埋時(shí)不能高溫、強(qiáng)光及長時(shí)間加熱。此制備工藝僅能反應(yīng)在微量條件下的情況,對(duì)日后大批量的工業(yè)生產(chǎn)僅作參考。
[1] HILLIAM M. Functional foods: the Western consumer viewpoint[J].Nutrition Reviews, 1996, 54(11): 189-194.
[2] KONO Y, KOBAYASHI K, TAGAWA S, et al. Antioxidant activity of polyphenolics in diets: Rateconstants of reactions of chlorogenic acid and caffeic acid with reactivespecies of oxygen and nitrogen[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1997, 1335(3): 335-342.
[3] 鄧良, 袁華, 喻宗沅, 等. 綠原酸的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)與生物工程,2005, 22(7): 4-6.
[4] 吳衛(wèi)華, 康楨, 歐陽冬生, 等. 綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(4): 691-694.
[5] NACZK M, AMAROWICZ R, SULLIVAN A, et al. Current research developments on polyphenolics of rapeseed/canola: a review[J]. Food Chemistry, 1998, 62(4): 489-502.
[6] CHANG Q, ZUO Z, CHOW M, et al. Effect of storage temperature on phenolics stability in hawthorn (Crataegus pinnatida var. major) fruits and a hawthorn drinkvar[J]. Food Chemistry, 2006, 98(3): 426-430.
[7] 王金宇, 李淑芬, 關(guān)文強(qiáng). 酵母細(xì)胞微膠囊化丁香油的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(4): 154-155.
[8] PANNELL N. Encapsulation of material in microbial cells: US, 5288632[P]. 1994-02-22.
[9] 梁治齊. 微膠囊技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999:157-161.
[10] BISHOP J, NELSON G, LAMB J. Microencapsulation in yeast cells[J].Journal of Microencapsulation, 1998, 15(6): 761-773.
[11] 趙永成. 高效液相色譜法測定杜仲葉中的綠原酸[J]. 色譜, 2005, 18(3): 262-264.
[12] SHI Guorong, RAO Liqun, YU Huazhong, et al. Yeast-cell-based microencapsulation of chlorogenic acid as a water-soluble antioxidan[J].Journal of Food Engineering, 2007, 80(4): 1060-1067.
[13] RAWEL H, ROHN S, KROLL J. Characterisation of 11S protein fractions and phenolic compounds from green coffee beans under special consideration: a review[J]. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 2005,101(4): 148-160.
[14] CLIFFORD M. The use of poly-n-vinylpyrrolidone as the adsorbent for the chromatographic separation of chlorogenic acids and other phenolic compounds[J]. Journal of Chromatography, 1974, 94(17): 261-266.
[15] 關(guān)炳峰. 金銀花中綠原酸類物質(zhì)的提取、抗氧化及抑菌特性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.
Microencapsulation of Chlorogenic Acid in Yeast Cells
LU Qi,CAO Shao-qian,LSi-yi,ZHOU Ying,GAO Li,PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
O625.31
A
1002-6630(2010)10-0137-05
2009-08-14
盧琪(1986—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail:chitty1986@yahoo.com.cn
*通信作者:潘思軼(1964—),男,教授,博士,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品的貯藏加工。E-mail:pansiyi@mail.huau.edu.cn