李 峰，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學院生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽 淮北 235000)

大豆活性肽酶解制備的工藝條件研究

李 峰，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學院生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽 淮北 235000)

以大豆分離蛋白為原料，選用堿性蛋白酶和風味蛋白酶，分別從酶解pH值、酶解溫度、酶用量和底物質量分數因素研究其對單酶酶解大豆分離蛋白的影響。并通過Minitab軟件，利用響應曲面試驗優(yōu)化雙酶酶解工藝條件。結果表明，其最佳酶解條件為酶解pH7.7、堿性蛋白酶用量為110mg/g底物、風味蛋白酶用量為90mg/g底物、酶解溫度56℃、底物質量分數8%、酶解時間7h，所得的大豆活性肽的分子量主要集中在1000D以下。

大豆活性肽；堿性蛋白酶；風味蛋白酶；水解度；制備工藝

Abstract ：To achieve an optimal degree of hydrolysis of soybean protein isolate (SPI) enzymatically hydrolyzed for the production of soybean bioactive peptides, single factor experiments were carried out to investigate 4 hydrolysis parameters(namely pH, hydrolysis temperature, enzyme dosage and substrate concentration) affecting Alcalase and Flavourzyme hydrolysis procedures of SPI and subsequently, according to experimental results, both enzymes were used for the combined hydrolysis of SPI and the optimal values of 4 hydrolysis parameters (namely pH, Alcalase dosage, Flavourzyme dosage and hydrolysis temperature) were investigated using a 4-variable, 3-level Box-Behnken design and response surface methodology. Results showed that a maximum degree of hydrolysis of SPI was achieved through the optimal double enzymatic hydrolysis for 7 h at 56 ℃ and pH 7.7 with Alcalase at a dosage of 110 mg/g substrate and Flavourzyme at a dosage of 90 mg/g substrate. Most of the soybean bioactive peptides obtained under such hydrolysis conditions exhibited a molecular weight below 1000 D.

Key words：soybean active protein；Alcalase；Flavourzyme；hydrolysis degree；production procedure

大豆活性肽是大豆分離蛋白經酶水解后再經過特殊處理而得到的寡肽混合物，是一類具有生理功能的活性物質。一般由2～9個氨基酸殘基組成，分子量分布以低于1000D的為主，主要在300～700D的范圍內[1]。近年來研究發(fā)現，人類攝取蛋白質經消化酶作用后，吸收形式主要是肽而不是氨基酸。大豆活性肽與大豆分離蛋白相比，它的氨基酸含量與大豆分離蛋白基本相同，必需氨基酸含量豐富；理化特性和營養(yǎng)價值更是優(yōu)于大豆分離蛋白。大豆活性肽沒有大豆腥味，口感良好；它具有抗疲勞[2]、抗氧化輻射[3-6]、降血壓血脂[7-9]、抗血栓、減肥以及調節(jié)免疫功能[10]、促進微生物的生長等作用；最近還發(fā)現大豆活性肽具有和鈣有效結合的活性基團，可以形成有機鈣多肽絡合物，使溶解性、吸收率和輸送速度都明顯地提高，防止骨質疏松。隨著科技的日新月異，大豆活性肽的其他生物功能也將被人們逐漸發(fā)現。大豆活性肽的優(yōu)勢使得它在普通食品、保健品、醫(yī)藥日化行業(yè)以及飼料行業(yè)[11-12]中有著廣泛的應用。為充分利用我國的大豆資源并提高它的經濟價值，對其進行深加工研究顯得尤為重要。目前，國內外研究多是從實驗室的角度采用酶水解大豆蛋白制備大豆活性肽[13]，研究出簡便、易行、高產、低耗、高效的大豆活性肽制備方法已經成為大豆活性肽開發(fā)利用中一個亟待解決的問題。

本實驗以大豆分離蛋白為原料，選堿性蛋白酶和風味蛋白酶為水解酶，分別以酶解pH值、酶解溫度、堿性蛋白酶(風味蛋白酶)的酶用量、底物質量分數等因素進行單因素試驗，以水解度為特征，分別研究兩種酶對水解大豆分離蛋白的影響；并通過Minitab軟件，設計四因素三水平的響應曲面分析試驗，優(yōu)化雙酶同時酶解的條件；最后利用單因素試驗確定水解時間。最后得到的水解液通過高效液相色譜檢測是否符合大豆活性肽的標準，即大豆分離蛋白水解度一般為30%～40%，大豆活性肽一般由2～9個氨基酸殘基組成，分子量分布以低于1000D為主，主要在300～700D的范圍內。本研究可為大豆活性肽進一步地分離提純和生理功能研究以及大規(guī)模工業(yè)生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龜2200大豆分離蛋白(蛋白質含量為94%) 日本不二制油公司；堿性蛋白酶、復合風味酶(酶活力為2×105U/g) 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司。

細胞色素C(MW12500D)、桿菌酶(MW1450D)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451D)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189D)標準樣品(色譜純) Sigma公司。

1.2 儀器與設備

膠體磨 溫州市七星乳占設備廠；PHS-3CT pH計上海康儀儀器有限公司；SYC-LB搖床 上海聯環(huán)生物工程設備有限公司；TGL-16A型離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；A200-IC氨基酸分析儀 德國安米諾西斯公司；K-355、K-435凱氏定氮儀 瑞士BUCHI公司；1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 指標測定方法

1.3.1 水解度(DH)

采用TCA法[13]測定。

式中：N2為大豆蛋白酶酶解上清液中加入體積分數為10%的三氯乙酸(TCA)溶液后的可溶性氮質量/mg(取10mL離心后的酶解液，加入10mL的10%的三氯乙酸溶液，振蕩，過濾后取上清液，用凱氏定氮法測定可溶性氮)；N1為反應前大豆分離蛋白上清液中加10%TCA溶液后的可溶性氮質量/mg(取10mL反應前大豆分離蛋白溶液，加入10mL的10%的TCA溶液，振蕩，過濾后取上清液，用凱氏定氮法測定可溶性氮；N0為大豆分離蛋白中總氮質量/mg(取等量的大豆分離蛋白，直接用凱氏定氮法測定氮)。

1.3.2 氮含量

采用凱氏定氮法測定。

1.3.3 分子量范圍

采用高效液相色譜法測定。TSK-G 2000色譜柱(7.8mm×300mm)，流速1.0mL/min，檢測波長220nm，進樣量5μL，柱溫30℃，流動相為體積分數12%乙腈(含體積分數0.5%乙酸)。

1.3.4 溶解度

將酶解液冷凍干燥制成大豆活性肽粉末，準確稱取1.000g粉末于50mL燒杯中，加入19mL水。在磁力攪拌器上攪拌，用0.2mol/L HCl溶液或NaOH溶液在2min內將pH值調至預定值。待pH值穩(wěn)定后再連續(xù)攪拌25min，并控制料液比為1:20。待浸提完全后離心(3000r/min，10min)，之后取上清液測定氮含量，并換算成氮溶解指數值，繪制出NSI-pH曲線。

1.4 大豆分離蛋白的酶解工藝

準確稱量大豆分離蛋白，用緩沖液(Na2HPO4和NaH2PO4)配制成一定的濃度。經過預處理(90℃加熱10min)后冷卻；加入一定量的酶；調pH值到預定值；在搖床里以一定的溫度和轉速反應一定的時間后放到水浴鍋進行沸水浴1min，使酶失活。迅速冷卻到室溫，4000r/min離心10min，測量其上清液的水解度。

1.4.1 單酶水解條件的初步確定

pH值對酶水解條件的影響：以溫度55℃、底物質量分數8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量110mg/g底物、反應時間6h的條件下，分別設定pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五個值進行實驗，測量其上清液的水解度。

溫度對酶解反應條件的影響：以pH7.5、底物質量分數8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量110mg/g底物、反應時間6h，分別設定溫度為45、50、55、60、65℃進行實驗，測量其上清液的水解度。

酶用量對酶水解條件的影響：以溫度55℃、底物質量分數8%、pH7.5、水解6h，分別設定酶用量為30、50、70、90、110mg/g底物五個值進行實驗，測量其上清液的水解度。

底物質量分數對酶解反應條件的影響：以溫度55℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量110mg/g底物、pH7.5、反應6h，分別設定底物質量分數為2%、4%、6%、8%、10%五個值進行實驗，測量其上清液的水解度。

1.4.2 雙酶酶解大豆分離蛋白最佳條件的確定

響應曲面分析最佳工藝參數：根據Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，結合以往的知識從中選出pH值、酶(堿性蛋白酶、風味蛋白酶)用量、溫度4個因素設計四因素三水平的相應曲面分析試驗，通過Mintab軟件進一步優(yōu)化雙酶酶解大豆分離蛋白的酶解條件。

反應時間的確定：以以上得到的條件為條件，分別設定反應時間4、5、6、7、8h進行試驗，測量其上清液的水解度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH值對酶解反應的影響

圖1 pH值對酶解反應的影響Fig.1 Effect of pH value on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

由圖1可知，在溫度55℃、底物質量分數8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量110mg/g底物、反應時間6h的條件下，堿性蛋白酶為pH8.0，風味蛋白酶pH7.5，其上清液的水解度達到最大值。

2.1.2 溫度對酶解反應的影響

圖2 溫度對酶解反應的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

由圖2可知，以pH7.5、底物質量分數8%、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量110mg/g底物的條件下反應6h，可發(fā)現堿性蛋白酶和風味蛋白酶均在溫度為55℃清液中的水解度達到最大值。

2.1.3 酶用量對酶水解條件的影響

由圖3可知，在溫度55℃、底物質量分數8%、pH7.5、水解6h的條件下，堿性蛋白酶用量為110mg/g底物，風味蛋白酶用量為90mg/g底物時，其上清液的水解度達到最大值，并且從經濟角度考慮為最好。

圖3 酶用量對酶解反應的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

2.1.4 底物質量分數對酶解反應條件的影響

圖4 底物質量分數對酶解反應的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis of SPI separately hydrolyzed with Alcalase and Flavourzyme

由圖4可知，以溫度55℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量110mg/g底物、pH7.5的條件下反應6h，底物質量分數為8%時其上清液的水解度達到最大值。在8%以上水解度變小的原因是由于大豆分離蛋白的黏度變大，酶與大豆分離蛋白的作用面積反而變小。

2.2 大豆分離蛋白最佳酶解條件的確定

2.2.1 響應曲面分析最佳工藝參數

響應曲面試驗中固定底物質量分數為8%，以水解度作為響應值，利用Minitab軟件設計四因素三水平的響應曲面試驗(表1)進行分析，結果見表2。

表1 響應曲面試驗的因素水平Table 1 Variables and levels in Box-Behnken design

表2 響應曲面試驗方案與結果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values of degree of hydrolysis of SPI hydrolyzed with both enzymes

2.2.1.1 回歸分析

表3 各因素的方差和交互作用Table 3 Regression analysis for fitted regression model describing degree of hydrolysis of SPI as a function of various hydrolysis conditions

由表3可以看出：pH值、堿性蛋白酶和風味蛋白酶對水解度有極顯著的影響，溫度影響不顯著；pH值和風味蛋白酶有顯著的交互作用；堿性蛋白酶和風味蛋白酶、pH值與堿性蛋白酶之間有顯著的交互作用，溫度和堿性蛋白酶、溫度和風味蛋白酶以及溫度和pH值沒有交互作用；利用Minitap軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，獲得水解度Y對pH值、堿性蛋白酶用量、風味蛋白酶用量和溫度的二次多項回歸模型方程為：

2.2.1.2 顯著性分析

表4 顯著性分析Table 4 Analysis of variance for fitted regression model describing degree of hydrolysis of SPI as a function of various hydrolysis conditions

由表4可知，失擬項0.077＞0.05，失擬項不顯著；線性、平方與交互作用的影響都是顯著的，因此各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

利用Minitab統計分析中響應曲面中的相應優(yōu)化器分析得到雙酶水解的最佳條件為pH7.7、溫度56℃(原數據為55.65℃)、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量90mg/g底物、底物質量分數8%，此時水解度達到37.37%。

2.2.2 反應時間的確定

以pH7.7、溫度56℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量90mg/g底物、底物質量分數8%為條件進行實驗。由圖5可知，在7h以后其上清液的水解度變化不大，從實際生產的經濟效應考慮選用7h。

圖5 時間對酶解反應的影響Fig.5 Time course of degree of hydrolysis of SPI hydrolyzed with both enzymes under optimized hydrolysis conditions

2.3 所得大豆分離蛋白酶解液的性質

2.3.1 相對分子質量范圍的檢測

標準分子量的HPLC圖譜見圖6。

圖6 標準分子量的HPLC圖譜Fig.6 HPLC profile of 4 mixed protein markers

以pH7.7、56℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物、風味蛋白酶用量90mg/g底物、底物質量分數8%、酶解7h得到的水解液進行高效液相色譜檢測，分析結果見表5。

表5 根據最佳條件酶解后的高效液相色譜分析結果Table 5 Molecular weight determination of 5 fractions shown in based on HPLC data

圖7 用最佳條件酶解后的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC profile of SPI hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

由圖7可知，分子量大于1112D的只占3.60%，分子量小于177D的占21.73%(這一部分大致為游離氨基酸所占的比例，所以游離氨基酸占總的氨基酸的含量小于21.73%)，其余為實驗所需的分子量范圍，即177～1000D，其占75%左右。

2.3.2 溶解性

圖8 pH值對NSI的影響Fig.8 Effect of pH value on NSI of SPI and its hydrolysate under optimized hydrolysis conditions

由圖8可知，大豆分離蛋白在酸性狀態(tài)下溶解性降低，特別是在pH4.5(大豆蛋白的等電點)時，蛋白質基本上不溶解而沉淀。而大豆活性肽的功能性質發(fā)生了明顯的改變，大豆活性肽在較寬的pH值范圍內仍保持良好的溶解狀態(tài)，溶液保持透明。溶解性增強是因為其體積變小，離子性增強，端基極性基團增加，使溶解度增加。

3 討 論

本實驗采用常用的堿性蛋白酶和風味蛋白酶進行酶解以及采用單因素結合響應曲面進行試驗，得到最佳工藝條件為pH7.7、溫度56℃、堿性蛋白酶用量110mg/g底物，風味蛋白酶用量90mg/g底物，底物質量分數8%、反應時間7h，此條件下，水解度達到37.37%。大豆分離蛋白酶解液分子量大于1112D的只占3.60%，分子量小于177D的占21.73%，其余為所需分子量范圍，占75%以上。大豆活性肽肽狀氮占氮的總量為75%，游離氨基酸占總的氨基酸的含量小于21.73%。大豆活性肽在較寬的pH值范圍內仍保持良好的溶解狀態(tài)，而大豆分離蛋白在酸性狀態(tài)下溶解性降低，特別是在pH4.5(大豆蛋白的等電點)時，蛋白質基本上不溶解而沉淀。通過研究所得到的樣品基本符合大豆活性肽的要求，即大豆活性肽一般由2～9個氨基酸殘基組成，分子量分布以低于1000D為主，主要在300～700D的范圍內。

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Enzymatic Production of Soybean Bioactive Peptides

LI Feng，PAN Yao，CHEN Qi
(Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology, College of Life Sciences, Huaibei Coal Industry Teacher’s College,Huaibei 235000, China)

TQ464.7

A

1002-6630(2010)10-0069-06

2010-02-03

安徽高校省級自然科學研究重點項目(KJ2008A086)

李峰(1970—)，男，副教授，博士，主要從事微生物生理、發(fā)酵及分子遺傳學研究。E-mail：rx2500@163.com