戴小斌 ，談獻(xiàn)和 ，吳 皓 ，王康才 ， 張 瑜

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210000)

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材，其性溫味辛，有毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功能[1]，是歷代醫(yī)家治療疾病的要藥。半夏塊莖的質(zhì)量是半夏藥材品質(zhì)及質(zhì)量控制研究的關(guān)鍵，半夏塊莖為植物的貯藏器官，含多種藥效成分，目前評價(jià)半夏質(zhì)量尚未有統(tǒng)一的成分指標(biāo)[2]，但以鳥苷和總生物堿作為半夏評價(jià)指標(biāo)成分已被廣泛應(yīng)用[3-7]。張科衛(wèi)等[8]在測定不同居群半夏藥材中鳥苷含量時(shí)得出，利用超聲水提，采用高效液相色譜法（HPLC）測定半夏藥材中的核苷含量（以鳥苷計(jì)），該法簡便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為半夏藥材中核苷含量的檢測。本課題采用該法測定半夏核苷類成分含量，比較不同居群之間的差異，為選育半夏優(yōu)良品種提供依據(jù)。本課題測定半夏總核苷類成分時(shí)以鳥苷計(jì)。

1 儀器與試藥

BP211D電子分析天平（德國Sartorious公司），H66025T超聲清洗機(jī) （無錫超聲電子設(shè)備廠），TDL-5離心機(jī)（centrifuge公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司），石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），Waters 2690高效液相色譜儀，996PDA二極管矩陣檢測器，Millinnium 32色譜工作站，色譜柱 ACE5 AQ（150 mm×4.6 mm，5 μm）。 尿嘧啶、黃嘌呤、尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取尿嘧啶、黃嘌呤、尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷對照品各 6.07、3.32、8.72、3.28、10.0 mg于 100 ml量瓶中，加蒸餾水定容，即為混合對照品儲備液。采用逐級稀釋法一次取混合對照品儲備液 1、5、10、15、20、25 ml至 100 ml量瓶中，加水至刻度，即以此為 1、2、3、4、5、6 號混合對照品溶液。以鳥苷計(jì)，各混合對照品溶液中鳥苷濃度分別為1、5、10、15、20、25 g/ml。

2.2 半夏樣品

共收集到11批樣品（表1），分別來自四川、山東、山西、江蘇、湖北、江西等六省的不同地區(qū)的半夏原藥材，經(jīng)我校藥植教研室談獻(xiàn)和教授鑒定為天南星科植物三葉半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖。將其在60℃烘干，打粉，過4號篩，即得本品粉末，貼上標(biāo)簽，做好記號，備用。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末約1 g，精密稱定，置離心管中，加入10 ml蒸餾水，超聲處理（功率 500 W，頻率 40 kHz）30 min，離心（3 000 r/min），將上層水液倒入蒸發(fā)皿中，如此超聲、離心重復(fù)3次，合并上層水液，置水浴鍋上蒸發(fā)濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得。每個(gè)樣品平行制備3份供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜條件的選擇：以乙腈-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析，流動(dòng)相為乙腈-水（0.1∶99.9），25 min 后以高濃度有機(jī)溶劑洗脫；測定波長：綜合五種化合物的紫外光譜，將其測定波長確定在 254 nm；柱溫：30℃；流速：0.8 ml/min。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取上述各不同鳥苷濃度的混合對照品溶液，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，記錄鳥苷對應(yīng)的保留時(shí)間處的峰面積。以對照品濃度對平均峰面積值進(jìn)行回歸，得到回歸方程為 A=5.730 2×107C-52 961（r=0.999 4），可見鳥苷在 0.928～24.734 g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖1。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取4號混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以鳥苷為指標(biāo)進(jìn)行精密度考察試驗(yàn)，得出RSD=0.07%，符合要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述半夏供試品溶液，隔2 h測1次，共測6次。結(jié)果表明，供試液中鳥苷在10 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.35%，符合要求。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取重慶半夏樣品粉末，平行處理6份，依法測定鳥苷含量，得出鳥苷含量RSD為2.40%，重復(fù)性良好。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取重慶半夏粉末共6份，各0.5 g，精密稱定，置50 ml具塞三角瓶中，分別加入對照品溶液稀釋液1 ml，再分別加入水至10 ml，與供試品溶液同法提取檢測。計(jì)算鳥苷的回收率為102.74%，RSD為2.91%，符合要求。

2.6 不同居群半夏中核苷的含量測定（以鳥苷計(jì)）

取上述供試品溶液進(jìn)樣，每份進(jìn)樣1次，進(jìn)樣量20 μl。取峰面積計(jì)算鳥苷含量，對照品溶液隨行對照。在檢測波長254 nm下，得出半夏對照品溶液和供試品溶液（以重慶半夏為例） 的 HPLC圖，分別以圖 2、3。 圖譜中 peak1、peak2、peak3、peak4、peak5分別代表尿嘧啶、黃嘌呤、尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷的保留值。圖3表明重慶半夏中5種核苷類成分均含有，而計(jì)算時(shí)則以鳥嘌呤核苷計(jì)。

2.7 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)（表1）表明，雖然由于操作失誤等原因，個(gè)別產(chǎn)地的個(gè)別編號未測出某些核苷類成分，但總體看，用于本次實(shí)驗(yàn)的各個(gè)批次半夏均含有尿嘧啶、黃嘌呤、尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、鳥苷等5種核苷類成分。

鳥苷含量計(jì)算方法：將各批次各編號半夏供試品溶液得出的鳥苷峰面積A代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得鳥苷濃度C（mg/ml）。鳥苷含量=C×10/（W×1 000）×100%。不同批次鳥苷含量比較，見表1。

表1 不同批次鳥苷含量比較

由上表得出，不同居群半夏中的核苷類成分含量存在顯著性差異，以鳥苷計(jì)，江蘇泰半夏核苷類成分含量最高，重慶半夏略低，兩者均達(dá)到了0.05%，而以湖北荊半夏最低，總體為0.016 1%～0.058 4%。

3 討論

半夏中總生物堿部位具有抗感染活性，其中所含的核苷類成分是抗感染主要活性組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀地反映了不同居屬地半夏品質(zhì)的差異，從藥效學(xué)角度為半夏的新品種選育研究提供參考，為更好地開發(fā)利用半夏資源奠定基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京∶化學(xué)工業(yè)出版社,2005∶78.

[2]郭巧生,段金廒,賀善安.半夏不同居群3種化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)比較研究[J].中國中藥雜志,2001,26(5)∶2961.

[3]張科衛(wèi),吳皓,崔小兵,等.不同產(chǎn)區(qū)半夏藥材中鳥苷含量的測定[J].中成藥,2000,22(1)∶7691.

[4]于超,張明,王宇,等.栽培、野生及不同產(chǎn)地半夏總生物堿測定[J].中國中藥雜志,2004,29(6)∶5831.

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[8]張科衛(wèi),吳皓,崔小兵,等.不同產(chǎn)區(qū)半夏藥材中鳥苷含量的測定[J].中成藥,2000,22(11)∶769.