梁成偉，張曉雯，宿烽，葉乃好

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 2660422; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

綠潮爆發(fā)后青島海域石莼屬綠藻的多樣性分析

梁成偉1，張曉雯2，宿烽1，葉乃好2

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 2660422; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

綠潮爆發(fā)后在青島沿海潮間帶采集了12株石莼屬綠藻，形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)這些綠藻進(jìn)行多樣性鑒定。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了12株藻的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列以及完整的5.8S rDNA序列。經(jīng)過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，不同藻株的ITS區(qū)域在序列長(zhǎng)度上存在差異；G＋C含量也存在差異，但是都處于較高的水平，最高的接近72%。ITS區(qū)域多序列比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這些藻株存在種的多樣性，而且由分子鑒定得出的多樣性與形態(tài)上呈現(xiàn)的多樣性并不完全一致。本研究結(jié)果顯示在青島海域綠潮爆發(fā)后石莼藻類仍然存在較好的多樣性。

石莼屬；ITS序列；多樣性

Abstract：Morphology combined with molecular biology were used to study the diversity of 12 strains of Ulva collected from Qingdao intertidal belt after largest macroalgal bloom in 2008.The nuclear-encoded ITS and associated 5.8S rDNA regions were obtained and sequenced.Sequence analysis revealed the ITS regions from different strains showed different patterns in length and G+C content.Furthermore,the frequencies of nucleotides G and C in ITS regions were at high level in all algal strains,and some were close to 72%.The results of alignment and phylogenetic tree showed these strains had diversity at species taxon.However,the polymorphism showed by morphology and molecular sequence was not consistent completely.In conclude,the results in this study revealed the diversity of Ulva algae in Qingdao belt after green tide.

Keywords:Ulva; ITS sequence; diversity

石莼屬（Ulva）屬于綠藻門 (Chlorophyta)、石莼科（Ulvaceae)的一屬，多數(shù)種類分布在溫帶至亞熱帶海洋中；生長(zhǎng)在高潮帶至低潮帶和大干潮線附近巖石上或石沼中，目前發(fā)現(xiàn)約有100個(gè)種包括在這個(gè)屬內(nèi)[1]。綠潮(Green tide)是世界沿海各國(guó)普遍發(fā)生的生態(tài)異?，F(xiàn)象，在歐洲、亞洲、北美洲和澳大利亞均有記錄，主要發(fā)生在河口、內(nèi)灣、潟湖和城市密集的海岸。造成綠潮的主要生物種類是石莼(Ulva sp.)和滸苔(Enteromorpha sp.)，以石莼居多[2]。近兩年來(lái)在山東地區(qū)的海域也頻頻暴發(fā)綠潮。2008年6月在黃海中南海域爆發(fā)的綠潮藻，經(jīng)鑒定為滸苔，并且造成本地綠潮藻并不是本地海域藻類的大量繁殖，而是由其他地區(qū)的海域漂浮而來(lái)的[3]。由于此次綠潮的爆發(fā)引起社會(huì)各界對(duì)漂浮滸苔高度關(guān)注，同時(shí)藻類學(xué)家在滸苔生理習(xí)性、繁殖周期及分子鑒定等方面也開展了一系列研究，并取得了一定的進(jìn)展[4-6]。但是與此相比，對(duì)于石莼的研究主要集中其生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)成分及在漁業(yè)方面的應(yīng)用[7-9]，而對(duì)于某一特定海域中石莼的分類多樣性研究的較少；青島海域石莼綠藻種類多樣性也未見報(bào)道。因此，青島海域在綠潮爆發(fā)以后，當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)藻類的多樣性如何引起我們的關(guān)注。

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物生物學(xué)方法首次在綠潮爆發(fā)后對(duì)青島海域范圍內(nèi)石莼藻類進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和種質(zhì)多樣性分析，為青島本土海域的綠藻資源提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)，為今后綠潮藻的來(lái)源分析和爆發(fā)機(jī)制的研究提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

在2009年4月對(duì)山東青島（市區(qū)、膠南、紅島、即墨）沿岸進(jìn)行石莼藻的采集并制作標(biāo)本。

1.2 模板DNA 的提取

將采集的藻類用無(wú)菌水清洗3遍，用吸水紙吸干，在液氮冷凍條件下將樣品研磨成粉末狀，利用天根植物全基因組提取試劑盒(DP320)提取全基因組DNA。

1.3 IST序列的擴(kuò)增

用PCR方法進(jìn)行從石莼樣本中獲得的ITS1-5.8S-ITS2序列。進(jìn)行ITS 擴(kuò)增的引物序列根據(jù)Leskinen 等[10]的結(jié)果設(shè)計(jì)，分別為T1(5'-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3')和 T2(5'-TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3')，由上海生物工程有限公司合成。PCR 反應(yīng)總體系為25 μL，其中包括：10×PCR buffer 2.5 μL，2.0 mmol/L MgCl22.0 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L 引物T1 和T2 各1 μL，Taq DNA 聚合酶(Promega)0.2 μL，DNA 模版1 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃ 變性1 min，54 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，將目的條帶回收純化之后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將獲得ITS序列用BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)。并從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載選代表性的物種的ITS 及5.8S rDNA 序列用于序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析,選用序列的登錄號(hào)及對(duì)應(yīng)的物種如下：AY422521 (U.Procera)、AB097648 (U.linza)、FJ002301 (U.proliferna)、AB097662 (U.armoricena)、AJ234316 (U.fenestrate)、AY260560(U.californica)、AB097644 (U.flexuosa)、AB298457 (Ulva sp.)、FJ194957 (Ulva sp.)、AF013981 (U.Compressa)。另外，加入由本實(shí)驗(yàn)室獲得的青島地區(qū)爆發(fā)的綠潮滸苔的ITS及5.8S rDNA 序列和外群序列AY360570 (P.percursa)。用Clustal X[11]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)及序列相似性分析。我們采用選取不同的方法（距離鄰接算法NJ、最大簡(jiǎn)約性算法MP和最大似然性算法ML）分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，上述建樹過(guò)程是在MEGA 4.0[12]和（或）PHYLIP軟件包中實(shí)現(xiàn)的。系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性是通過(guò)Bootstrap方法重抽樣1 000次進(jìn)行的。

2 結(jié) 果

2.1 不同藻株的形態(tài)及分布

從山東海域潮間帶采集石莼樣本在形態(tài)、色澤存在較大的差別，石莼樣本的形態(tài)見圖1。從外觀可以看出，所采集的樣本在形態(tài)上存在多樣性。有些樣本為膜狀體，呈寬葉片狀或裂成許多小葉片，如SH107、SH102、SH105;有些石莼樣本呈狹長(zhǎng)的絲帶狀，如SH101、SH104、SH108、SH106； 有些石莼樣本呈管狀，并且分枝，藻體基部生出假根絲，形成固著器，如SH103、SH202、SH204；還有些石莼藻株成簇成長(zhǎng)，如：SH201和SH203。

2.2 ITS序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得600 bp左右的序列片段，包括部分 18S rDNA 和完整的 ITS1序列，5.8S rDNA序列、ITS 2 序列和部分28 S rDNA 序列。不同的藻株ITS1 長(zhǎng)度不等（表1），SH105藻株的ITS1 序列最短，只有 152bp，而 SH104 、SH106和 SH108 三株藻的 ITS區(qū)域較長(zhǎng)，有 196bp。SH202、SH204、SH101、SH102和SH107 具有相同長(zhǎng)度的ITS1區(qū)域，長(zhǎng)度為189 bp。 5.8S rRNA基因大小差別不大，除了SH203以外，其余藻株的5.8S rDNA的長(zhǎng)度都是160 bp。通過(guò)比較ITS2區(qū)域的長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)具有最短ITS1區(qū)域的SH105藻株，卻具有最長(zhǎng)的ITS2 區(qū)域，為199 bp，而其他的藻株ITS2區(qū)域長(zhǎng)度范圍從175 bp到187 bp。

對(duì)ITS 1，5.8S r DNA 和ITS 2 區(qū)域的核苷酸組分分析，發(fā)現(xiàn)在ITS區(qū)域均具有較高的G+C含量，范圍大約在62% 到70% 之間。而5.8 S rDNA的G+C的含量基本上都接近50%（表1）。

2.3 多序列比對(duì)

從序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)看（圖2），在核糖體RNA編碼區(qū)（包括 18S、5.8S、28S ）是比較保守的，但是在ITS區(qū)域不同物種序列比對(duì)時(shí)會(huì)產(chǎn)生很多間隙（gaps）。并且，在ITS1 區(qū)域內(nèi)序列差異較大，由比對(duì)產(chǎn)生的間隙也較多。在藻株SH105 ITS 1序列中，產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)13個(gè)堿基的比對(duì)間隙。在ITS2中，雖然核苷酸之間的差異也較大，但是產(chǎn)生比對(duì)空隙的區(qū)域較少。

圖1：青島潮間帶采集的石莼藻株樣品的形態(tài)特征Fig 1.Morphological characteristics of Ulva colleted from the intertidal belt in Qingdao

表1 不同藻株 ITS 1,5.8S rDNA 和ITS 2 區(qū)域的長(zhǎng)度(n=核酸的數(shù)目)和GC含量Tab.1.Length (n=number of nucleotides)and GC% of ITS 1,5.8S rDNA and ITS 2 in different Ulva algae

2.4 藻株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

為構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了10個(gè)石莼屬的ITS 和5.8S rDNA 的全序列，并以狹帶藻(Percursaria percursa)的ITS 和5.8S rDNA全序列作為外群[13]。采用Mega4.0 中的鄰接法及Phylip3.65 軟件中的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建了ITS 及5.8S rDNA 的系統(tǒng)進(jìn)化樹，兩棵進(jìn)化樹具有類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，說(shuō)明了系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性。文中給出的是NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)樹，從該系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出（圖3），采集到的石莼藻株在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為5個(gè)不同的類群中：其中藻株SH201，SH202，SH203 與U.compressa 聚為一大分支；藻株SH104、SH106和SH108 與U.califormica和U.flexuosa聚在一個(gè)大分支；藻株SH105與U.fenetrata 和U.armoricana聚為一個(gè)分支；藻株 SH101、SH107、SH102、SH204與U.proliferna、U.linza、U.Procera以及爆發(fā)綠潮藻聚為一大分支；SH103與兩個(gè)未確定物種的石莼屬藻類聚在一起。

圖2 不同藻類樣品ITS1、5.8S和ITS2 全序列比對(duì)結(jié)果（“﹒”表示與最上面一行的核酸一致； “-”表示產(chǎn)生的比對(duì)空隙）Fig.2.The alignment of sequences of IST (including ITS1,5.8S and ITS2)from different Ulva algae.“﹒” this sign indicates a nucleotide indentical with that on the top row,and “-” represents an alignment gap.

圖3 利用NJ法構(gòu)建的ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequences constructed by Neighbor-Joining Method

3 討 論

真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括 3種：28S rDNA,18S rDNA和5.8 S rDNA。它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列,相互之間由間隔區(qū)分隔。間隔區(qū)是位于核糖體大小亞基基因之間的核苷酸序列。位于18S rDNA的3′端與5.8S rDNA的5′端之間的序列稱為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1(internal transcribed spacer 1，ITS1)位于5.8S rDNA的3′端與28S rDNA的5′端之間的序列稱為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 2 (internal transcribed spacer 2,ITS2)。28S rDNA的3′端與18S rDNA的5′端之間的序列稱為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal genic spacer，IGS)。這 3種核糖體基因及間隔區(qū)有不同的進(jìn)化程度,有的序列比較保守,有的序列進(jìn)化較快,因此，可以根據(jù)它們的序列,將藻類鑒定到屬、種、亞種、變種的水平。

由于藻類隨著分布海域的不同而在形態(tài)、色澤以及藻體大小等方面會(huì)表現(xiàn)出明顯的差異，僅僅根據(jù)形態(tài)學(xué)判斷藻類的分類地位較為困難，所以現(xiàn)在通常借助于分子標(biāo)記在種一級(jí)分類地位上進(jìn)行確定。在本文中，我們擴(kuò)增得到了青島海域石莼（Ulva）藻ITS序列包括5.8S rDNA 序列，通過(guò)比較ITS序列的多態(tài)性結(jié)合了藻類的形態(tài)特征首次研究了在生長(zhǎng)在青島海域的石莼類藻的多樣性。通過(guò)比較ITS序列的長(zhǎng)度和GC含量發(fā)現(xiàn)，這些不同的藻株在ITS區(qū)域序列長(zhǎng)度差異較大，其中ITS 1序列長(zhǎng)度差可達(dá)到 44 bp，通過(guò)多序列比對(duì)，也發(fā)現(xiàn)ITS1區(qū)域內(nèi)存在較多的間隙，說(shuō)明ITS區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中插入或刪除事件是很普遍發(fā)生的。核苷酸組分分析發(fā)現(xiàn)，所采集的藻類的ITS區(qū)域的G+C含量也存在一定差異（表1），但是都處在較高水平。通常情況下，ITS1和ITS2 區(qū)域雖然中間間隔5.8S r DNA，但具有相近的G+C含量[14]。植物中，ITS區(qū)域的 G+C含量從 50% 左右到水稻中高達(dá)75%[15,16]，在以前的文獻(xiàn)中也報(bào)道其他的綠藻 ITS中的G+C含量都低于60%，接近50%[17]。與ITS系列不同，在我們所測(cè)的樣品中，5.8S rDNA中G+C含量與其他的高等植物或綠藻中的含量較接近。在石莼屬綠藻中ITS區(qū)域的高G+C含量，可能是由于進(jìn)化過(guò)程中受到堿基突變壓力，或受到高 G+C含量的選擇或者其他因素的影響。ITS序列長(zhǎng)度及核苷酸組分都顯示了這些藻類在分子水平上呈現(xiàn)了多態(tài)性。

根據(jù)ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，采集的藻類在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在5個(gè)不同的分支上，說(shuō)明它們?cè)诜N的水平上存在多樣性，甚至存在種內(nèi)多樣性，例如藻株SH106和SH108，很可能呈現(xiàn)出來(lái)是種內(nèi)的多樣性。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹來(lái)看，在分子水平上呈現(xiàn)的多樣性并不完全與形態(tài)上呈現(xiàn)的多樣性一致，對(duì)兩種方法存在的差異進(jìn)行了比較（圖4）。例如，藻株SH103、SH202、SH204在形態(tài)上比較接近（圖1），但是它們分別位于不同的進(jìn)化支上。SH104、SH108、SH106在形態(tài)上比較接近，它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育樹上也呈現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。SH101、SH102、SH107、SH204與青島地區(qū)綠潮爆發(fā)藻類具有較近的親緣關(guān)系。從分子鑒定結(jié)果可以看出在滸苔綠潮爆發(fā)之后，在青島海邊并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)定生的黃海漂浮滸苔，而且對(duì)當(dāng)?shù)厥粚僭孱惖亩鄻有杂绊懖淮?。本研究首次?duì)青島海域石莼屬藻類多樣性的進(jìn)行研究，今后將會(huì)對(duì)綠潮藻的鑒定及來(lái)源分析提供一定的幫助。

圖4 分子鑒定得出的多樣性與形態(tài)上呈現(xiàn)的多樣性的比較（A 圖中分支代表藻類具有相似的形態(tài)； B 圖中分支代表在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同于分支）Fig.4 Comparison of the morphology diversity and the diversity presented by molecular identification.The branch represents the similar morphology among different strains in figure A; the branch in figure B represents the different strains clade in the phylogenetic tree.

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Analysis of diversity of Ulva in Qingdao after the largest macroalgal bloom

LIANG Cheng-wei1,ZHANG Xiao-wen2,SU Feng1,YE Nai-hao2
（1.Chemical Engineering College,Qingdao University of Science & Technology,Qingdao 266042,China;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China）

Q949.21+3; Q16 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A

1001-6932(2010)05-0540-06

2009-08-25；

2009-12-26

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（09-2-5-8-hy）；山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2009EM013,Y2008D03）；國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2009ZX08009-019B）；化學(xué)工程山東省強(qiáng)化建設(shè)學(xué)科（青島科技大學(xué)）開放基金；青島市科技計(jì)劃項(xiàng)目（08-1-3-27-jch）

梁成偉（1979－），女，講師，主要研究方向：藻類分子生物學(xué)。電子郵箱：liangchengwei@qust.edu.cn

葉乃好，電子郵箱：yehn@ysfri.ac.cn