方洪壯，李睿，孫長(zhǎng)海，李利，張宇（.佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，佳木斯市 54007；.黑龍江科倫制藥有限公司，慶安市 5400）

莪術(shù)油葡萄糖注射液滅菌前后指紋圖譜相關(guān)性研究Δ

方洪壯1＊，李睿1，孫長(zhǎng)海1，李利2，張宇1（1.佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，佳木斯市 154007；2.黑龍江科倫制藥有限公司，慶安市 152400）

目的：研究滅菌前后的莪術(shù)油葡萄糖注射液指紋圖譜的相關(guān)性，為建立莪術(shù)油葡萄糖注射液指紋圖譜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法分離測(cè)定，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。通過(guò)共有模式方法比較指紋圖譜的相關(guān)性；用成對(duì)比較t檢驗(yàn)法比較單一色譜峰強(qiáng)度的變化。結(jié)果：莪術(shù)油葡萄糖注射液滅菌后較滅菌前多數(shù)色譜峰峰面積明顯變小，并增加了一些小峰。結(jié)論：莪術(shù)油葡萄糖注射液滅菌前后的指紋圖譜間均有較好的相關(guān)性。

莪術(shù)油葡萄糖注射液；指紋圖譜；相關(guān)性；高效液相色譜法

Δ黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（11521277）

＊教授。研究方向：藥物分析。電話：0454-8611265。E-mail：fhz-chjms@163.com

莪術(shù)油為溫莪術(shù)經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油[1]，含多種藥理活性成分。莪術(shù)油葡萄糖注射液為莪術(shù)油加葡萄糖和適當(dāng)助溶劑制成的含藥輸液劑，作為抗病毒藥收載于2005年版《中國(guó)藥典》（二部）[2]。中藥注射劑指紋圖譜的相關(guān)性是中藥指紋圖譜研究的重要內(nèi)容[3，4]，有多個(gè)品種注射劑、提取物、中間體和藥材之間相關(guān)性的研究報(bào)道[5～9]，但未見注射劑滅菌前后之間的指紋圖譜相關(guān)性研究。相關(guān)性的比較方法，現(xiàn)為整體上的共有模式間相似度計(jì)算和直觀分析及單一色譜峰的直觀比較。本試驗(yàn)測(cè)定滅菌前后莪術(shù)油葡萄糖注射液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并比較它們之間的相關(guān)性；在單一色譜峰強(qiáng)度變化的比較上，引入了統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法，可克服單一色譜峰直觀比較的誤判。試驗(yàn)結(jié)果可為控制莪術(shù)油葡萄糖注射液的質(zhì)量和提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1100系列HPLC儀，包括G1379A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣儀、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

10批溫莪術(shù)藥材由天瑞制藥有限公司提供，經(jīng)佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院宗希明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，莪術(shù)油分別由各批溫莪術(shù)藥材粗粉加8倍量水，按《中國(guó)藥典》揮發(fā)油提取甲法提取5 h制得，注射液按相應(yīng)制劑工藝要求制成，分作不經(jīng)滅菌部分和滅菌部分；莪術(shù)二酮標(biāo)準(zhǔn)品（上海滬云醫(yī)藥開發(fā)有限公司，純度：99.6%）；莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為0080-20050521、10753-200212、00268-200401）；葡萄糖粉、依地酸二鈉、吐溫-80均為注射用，乙腈、甲醇為色譜純，磷酸、無(wú)水硫酸鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 注射液供試液：分別取滅菌前后莪術(shù)油葡萄糖注射液直接作為注射液供試品溶液，分別記為供試液A和供試液B。

2.1.2 陰性溶液：取0.36 g吐溫-80，再加入5 mg依地酸二鈉，用5%葡萄糖溶液定容至100 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為不含莪術(shù)油的陰性溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液：分別取莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮及β-欖香烯對(duì)照品適量，用甲醇制成4種對(duì)照品的混合溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），Zorbax Eclipse XDB C18保護(hù)柱（12.5 mm×4.6 mm ID，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（A相：0～5 min，55%；5～30 min，75%；30～45 min，90%；45～55 min，90%，55 min后，100%）；流速：1 mL·min-1；注射液與揮發(fā)油供試液的光譜-色譜圖顯示，210 nm波長(zhǎng)處的信號(hào)強(qiáng)度、分離度、峰形與柱效均較為理想，60 min后無(wú)明顯色譜峰，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為210 nm；色譜記錄時(shí)間為60 min。

2.3 成分的歸屬

取供試液A、對(duì)照品溶液和陰性溶液各20μL，分別進(jìn)樣，色譜見圖1。

圖1 HPLC指紋圖譜A.供試品；B.對(duì)照品；C.陰性溶液；S1.莪術(shù)二酮；S2.莪術(shù)醇；S3.吉馬酮；S4.β-欖香烯Fig 1 HPLC fingerprintsA.test sample；B.reference substance；C.negative solution；S1.curdione；S2.curcumol；S3.germacrone；S4.β-elemene

由圖1可知，色譜中保留時(shí)間為13.5、18.8、25.5及51.6 min處的S1、S2、S3及S4色譜峰分別歸屬于莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮及β-欖香烯；注射液中的葡萄糖和其它輔料對(duì)莪術(shù)油葡萄糖注射液的色譜峰無(wú)干擾。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度：取同一供試液A，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，所得到的指紋圖譜與其中位值的相關(guān)系數(shù)分別為0.997 2、0.999 5、0.998 1、0.999 7和0.995 5，均＞0.99；相對(duì)應(yīng)的RSD＝0.17%。各圖譜能夠很好地重合，表明儀器精密度較好。

2.4.2 穩(wěn)定性：取同一供試液A，分別在0、4、8、12、18和24 h進(jìn)樣。不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的圖譜與其均值的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 9、0.995 8、0.998 1、0.999 5、0.994 0 和 0.990 4，均＞0.99；相對(duì)應(yīng)的RSD＝0.35%，表明樣品在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定10批滅菌前后的莪術(shù)油葡萄糖注射液，按全譜方式以中位數(shù)法分別建立共有模式（見圖2）。滅菌前后的注射液指紋圖譜均選取9個(gè)共有峰，分別占總峰面積的83.42%和66.64%，其中2、4、6、8號(hào)峰分別為莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮及β-欖香烯的特征峰。滅菌后10批樣品與其共有模式的相關(guān)系數(shù)分別為0.962 9、0.992 3、0.995 2、0.926 8、0.992 0、0.996 3、0.997 6、0.989 8、0.995 0和0.976 3，均＞0.92；滅菌前10批樣品與其共有模式的相關(guān)系數(shù)分別為0.960 2、0.987 5、0.996 4、0.890 7、0.989 6、0.994 3、0.996 2、0.989 0、0.998 5和0.984 6，均＞0.89。

2.6 指紋圖譜相關(guān)性分析

圖2 滅菌后與滅菌前注射液指紋圖譜的共有模式A.滅菌后；B.滅菌前Fig 2 Common fingerprints pattern of injection before and after sterilizationA.before sterilization；B.after sterilization

2.6.1 共有模式相關(guān)性：由圖2的指紋圖譜共有模式可見，注射液滅菌前后在HPLC指紋特征上相似。注射液滅菌后，色譜保留時(shí)間8 min前增加了一些小峰、出現(xiàn)了一些微量物質(zhì)，部分特征峰的強(qiáng)度發(fā)生了一些變化。對(duì)滅菌前后的注射液指紋圖譜的共有模式進(jìn)行相似度計(jì)算得到，滅菌前后間的相關(guān)系數(shù)為0.936 0。

2.6.2 共有峰比較：圖3為中位數(shù)共有模式下的共有峰面積柱型圖，共有峰分別以1～9標(biāo)記。由圖3可見，莪術(shù)油注射液滅菌后的共有峰僅莪術(shù)醇（標(biāo)記為4）峰面積變大，其余峰面積變小。共有峰面積統(tǒng)計(jì)學(xué)的成對(duì)比較t檢驗(yàn)結(jié)果可知，各峰的檢驗(yàn)計(jì)算值分別為7.99、27.0、11.1、12.0、9.19、18.9、8.88、8.76及15.2，均＞檢驗(yàn)的臨界值3.25（P＝0.01），表明滅菌前后共有峰面積間有高度顯著差異。

圖3 共有峰面積柱型圖A.滅菌注射液；B.未滅菌注射液Fig 3 Columnar diagram of common peak areaA.sterilized injection；B.non-sterilized injection

3 討論

3.1 共有峰的選擇

莪術(shù)油葡萄糖注射液指紋圖譜中，多數(shù)峰的強(qiáng)度較小，本試驗(yàn)選用峰面積最大的吉馬酮為參照物，以超過(guò)其峰面積5%、保留時(shí)間和峰面積均比較穩(wěn)定的色譜峰為共有峰。

3.2 相似性比較

中藥的藥材、提取物及制劑的色譜指紋圖譜間單一共有峰相似性的比較，僅見直觀比較，有時(shí)難以給出確切的判定。如滅菌前后的1號(hào)峰在直觀上較接近，但統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著差異，可見統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可克服對(duì)峰強(qiáng)度變化的直觀誤判。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：279.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：592.

[3]王 旭，王國(guó)榮.中藥注射劑指紋圖譜研究的現(xiàn)狀和分析[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：48.

[4]楊東風(fēng)，梁宗鎖.中藥指紋圖譜研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2008，19（6）：467.

[5]饒春愷，羅順德，雷嘉川，等.當(dāng)歸注射液指紋圖譜初步研究[J].中成藥，2003，26（10）：775.

[6]游 松，王 亮，蔣雅紅，等.銀杏葉注射劑指紋圖譜的研究[J].中草藥，2002，33（3）：216.

[7]蘭燕宇，劉麗娜，王永林，等.注射用復(fù)方葒草（凍干粉針）指紋圖譜研究[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（6）：440.

[8]羅遠(yuǎn)秀，文東旭，蔣受軍，等.巖黃注射液與藥材及提取物間指紋圖譜相關(guān)性研究[J].藥物分析雜志，2007，27（7）：1 014.

[9]唐旭利，劉 靜，李國(guó)強(qiáng)，等.注射用丹紅（粉針）-中間體-藥材HPLC指紋圖譜相關(guān)性研究[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，39（1）：61.

Study on Fingerprints Correlation of Zedoary Turmeric Oil and Glucose Injection before and after Sterilization

FANG Hong-zhuang，LI Rui，SUN Chang-hai，ZHANG Yu（College of Chemistry and Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）
LI Li（Heilongjiang Kelun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Qing’an 152400，China）

OBJECTIVE：To study fingerprints correlation of Zedoary turmeric oil and glucose injection before and after sterilization，and to provide reference for the establishment of detecting standard of fingerprints of Zedoary turmeric oil and glucose injection.METHODS：HPLC method was used.The separation was performed on Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid water（gradient elution）at flow rate of 1 mL·min-1.The column temperature was set at 30℃and detection wavelength was 210 nm.The fingerprints correlation was compared by the method of common pattern.The change of the unity chromatographic peak was analyzed by pairedt-test.RESULTS：After sterilization，the chromatographic peak areas of the injection were obviously diminished and some tiny chromatographic peaks appeared.CONCLUSION：There is a good relationship between the fingerprints of Zedoary turmeric oil and glucose injection before and after sterilization.

Zedoary turmeric oil and glucose injection；Fingerprints；Correlation；HPLC

R283.61；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3702-03

2009-11-01

2010-04-09）