沈 霞, 張艷紅, 袁慧慧, 藍(lán)閩波,2＊

(1.華東理工大學(xué)分析測試中心,上海 200237;2.華東理工大學(xué)超細(xì)材料制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉粗多糖提取工藝的研究

沈 霞1, 張艷紅1, 袁慧慧1, 藍(lán)閩波1,2＊

(1.華東理工大學(xué)分析測試中心,上海 200237;2.華東理工大學(xué)超細(xì)材料制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

艾葉多糖;提取;響應(yīng)面分析;優(yōu)化

目的:利用響應(yīng)面分析法(Response SurfaceMethodology,RS M)對(duì)艾葉多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取實(shí)驗(yàn)因素與水平,根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法,以獲得多元二次線性回歸方程,以多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線。結(jié)果:確定了水浸提艾葉多糖最佳工藝條件:浸提溫度99℃,浸提時(shí)間2.3 h,水料比20。結(jié)論:在此條件下,艾葉多糖的提取率可達(dá)3.017%,與理論預(yù)測值3.096%的相對(duì)誤差為2.6%。

KEY WORDS:foliumA rtem isia argyipolysaccharide;extraction;response surface methodology;optimization

ABSTRACT:A IM:To optimize the extraction of foliumA rtem isia argyipolysaccharides by the use of response surface methodoloy.M ETHODS:Exper iment factors and levelswere first selected on the ground ofone factor test. Alongwith the central composite experimental design principles,the response surface methodoloywith three factors and three levelswas adopted in search ofmultiple quadratic linear regression.Response surface and contourwere finally chosen as the extraction rate and the response value respectively.RESULTS:The optimum extraction conditions of the polysaccharides from foliumA rtem isia argyiwere concluded as follows:extraction temperature was at 99℃,extraction time was 2.3 hours,ratio of 20.CONCLUSI ON:Under these conditions,the yield of foliumA rtem isia argyipolysaccarides is up to 3.017%,extraction rate of the predictive best polysaccharides is 3.096%,and the relative error is 2.6%.

艾葉(folium A rtem isia argyi),別名大艾葉、杜艾葉、萎蒿,為菊科A rtem isia argyilevl.et vant植物艾的葉。作為一種傳統(tǒng)中藥,艾葉已廣泛應(yīng)用于治療婦科疾病、呼吸道疾病、風(fēng)濕及皮膚外科疾病中[1]?；瘜W(xué)成分研究表明艾葉中含有揮發(fā)油、黃酮、腺嘌呤、鞣質(zhì)、甾醇、萜類、多糖、微量元素及其他有機(jī)成分[2]。對(duì)艾葉多糖的研究鮮有報(bào)道,本課題組近年來對(duì)艾葉多糖的提取分離及藥理活性進(jìn)行了一系列研究[3-5],發(fā)現(xiàn)艾葉多糖具有很好的抗氧化能力和很強(qiáng)的抗腫瘤活性和免疫促進(jìn)作用。

目前大多數(shù)提取工藝的優(yōu)化模型為正交試驗(yàn),響應(yīng)面分析法優(yōu)化多糖提取工藝的研究報(bào)道較少。劉軍海等人已對(duì)白術(shù)、杜仲葉等用響應(yīng)面分析法進(jìn)行了提取工藝參數(shù)的優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠[6-8]。

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法對(duì)艾葉多糖水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,以期為艾葉多糖的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

艾葉(購自河北安國藥材市場,產(chǎn)地湖北蘄春),濃硫酸(AR)、蒽酮(AR)、葡萄糖(AR)、蒸餾水。

FA2004電子天平(上海良平儀器儀表有限公司);恒溫水浴鍋(鞏義市英峪高科儀器廠);JL系列電熱器(江蘇建湖蘆溝電熱器廠);循環(huán)水多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);UV-2102 PC紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司); SAKO變壓器(三科電器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量的測定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配置 精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖20 mg,置于100 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.1.2 供試品溶液的制備 稱取乙醇脫脂后干燥的艾葉5.0 g,熱水浸提,過濾,濾液定容至250 mL量瓶中,搖勻,即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL置于10 mL比色管中,加蒸餾水至2.0 mL,最后加入8.0 mL 0.2%硫酸-蒽酮溶液,搖勻,迅速放入冰水浴中2～3 min,浸入沸水浴中煮沸15 min,取出后冷水冷卻,以試劑空白為參比,于580 nm處測定吸光度,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(μg/mL)=22.988 5A-0.431 8(r=0.998)。

2.1.4 多糖提取率的測定 采用硫酸-蒽酮[9]法測定多糖含量,取0.2 mL供試品溶液,按2.1.3項(xiàng)操作進(jìn)行吸光度測定,測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出比色液濃度。由下式得到多糖提取率:

多糖提取率(%)=[比色液濃度(μg/mL)×比色液體積(10 mL)×定容體積(250 mL)]/[供試樣品體積(0.2 mL)×供試樣品質(zhì)量(5 g)×106]× 100

2.2 熱水浸提工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 水料比對(duì)提取率的影響 在本實(shí)驗(yàn)中,水料比是提取所用的溶媒水的質(zhì)量與艾葉質(zhì)量的比值。在90℃條件下,分別采用10、15、20、25、30的水料比進(jìn)行實(shí)驗(yàn),加熱回流1.5 h。

圖1 水料比對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可知,多糖提取率隨著水料比的增加呈現(xiàn)增大的趨勢,但是當(dāng)水料比達(dá)到15之后,多糖提取率增加緩慢,考慮到節(jié)約能耗和提高工作效率,選擇15、20、25作為中心組合實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平參數(shù)。

2.2.2 溫度對(duì)提取率的影響 選擇水料比為20,分別在60、70、80、90、100℃溫度條件下加熱回流1.5 h,所得結(jié)果見圖2。

圖2 浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖2可知,考慮到高溫可能對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)以及活性有一定的影響,超過100℃會(huì)使多糖產(chǎn)生降解,因此,在中心組合實(shí)驗(yàn)中分別選取80℃、90℃和100℃作為浸提溫度的三個(gè)水平參數(shù)。

2.2.3 時(shí)間對(duì)提取率的影響 在90℃、水料比為20時(shí),分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h,考察提取率的影響。

由圖3可知,多糖的提取率隨著時(shí)間的增加,呈現(xiàn)先上升再下降的總體趨勢,當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)提取率達(dá)到最大。這說明,提取時(shí)間對(duì)多糖的提取率有比較顯著的影響,時(shí)間過短,提取不充分,時(shí)間過長,可能引起多糖分解,導(dǎo)致提取率下降,因此中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇1.5 h、2 h、2.5 h作為浸提時(shí)間的三個(gè)水平參數(shù)。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10,11]。選取影響艾葉多糖提取率的三個(gè)主要因素浸提溫度、時(shí)間、水料比進(jìn)行優(yōu)化組合?？疾炷繕?biāo)為多糖提取率,提取率測定參照2.1.4項(xiàng),試驗(yàn)因素水平安排見表1。

表1 中心組合試驗(yàn)方案

對(duì)浸提溫度(Z1)、時(shí)間(Z2)、水料比(Z3)作如下變換X1=(Z1-90)/10、X2=(Z2-2)/1、X3=(Z3-20)/10,以X1、X2和X3為自變量,以多糖提取率(Y)為響應(yīng)值,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。采用Stabtistic 6.0軟件處理得響應(yīng)面分析結(jié)果見圖4～6。

采用SAS RSREG程序?qū)憫?yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后,得到回歸方程:

圖4 浸提溫度(X1)與時(shí)間(X2)對(duì)多糖提取率(Y)影響的響應(yīng)面與等值線

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

通過降維法,可以得到以下3個(gè)偏子回歸模型:

令dYi/dXi=0(i=1,2,3)可求出極大值時(shí)各種因素單獨(dú)最適量:X1=0.898,X2=0.272,X3= 0.192,代入前述的變換公式浸提溫度(Z1)、時(shí)間(Z2)、水料比(Z3),即艾葉多糖浸提工藝最佳工藝條件為采用水為溶劑,提取溫度98.8℃,水料比20.2,提取時(shí)間2.27 h。在此條件下進(jìn)行提取,由回歸方程預(yù)測艾葉多糖提取率為3.096%。

圖5 浸提溫度(X1)與水料比(X3)對(duì)多糖提取率(Y)影響的響應(yīng)面與等值線

圖6 浸提時(shí)間(X2)與水料比(X3)對(duì)提取率(Y)的響應(yīng)面與等值線

為檢驗(yàn)RS M分析法的可靠性,直接將RS M法獲得的最優(yōu)浸提條件,進(jìn)行多糖的浸提驗(yàn)證試驗(yàn),同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利,將艾葉浸提粗多糖的最優(yōu)條件修正為浸提溫度99℃、時(shí)間2.3 h、水料比20,在此優(yōu)化條件下共進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4。測得艾葉多糖的實(shí)際提取率為3.017%,與理論預(yù)測值的相對(duì)誤差為2.6%。

表4 艾葉多糖驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法對(duì)艾葉多糖提取工藝優(yōu)化的結(jié)果表明,艾葉多糖水浸提的最佳工藝條件為:浸提溫度99℃,時(shí)間2.3 h,水料比20。在此條件下,實(shí)際提取率3.017%,與理論預(yù)測值3.096%的相對(duì)誤差為2.6%。由此可見,采用RS M分析法優(yōu)化得到的浸提條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1] 梅全喜.艾葉[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,1999:10.

[2] 吳貽谷,宋立人.中華本草[M].上海:上海科技出版社,1999: 1864.

[3] 藍(lán)閩波,何正有,郁榮華,等.一種艾葉多糖及其用途[P].中國CN101067004A[P].2007-05-16.

[4] 藍(lán)閩波,何正有,鄭 穎,等.艾葉多糖提取物的用途[P].中國CN1962698A[P].2007-11-07.

[5] 袁慧慧,殷日祥,陸冬英,等.艾葉提取工藝及抗氧化活性的研究[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,31(12): 768-771.

[6] 劉軍海,任惠蘭,官 波,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化白術(shù)多糖提取工藝[J].中成藥,2008,30(5):667-670.

[7] 劉軍海,任惠蘭,段玉蘭,等.杜仲葉多糖提取工藝研究[J].食品科學(xué),2007,28(7):264-267.

[8] 李亞娜,林永成,佘志剛.響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,32(11): 29-31.

[9] 陳 平,陳 新,王 琿,等.硫酸–蒽酮法測定鄂產(chǎn)竹節(jié)參多糖含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(12):1654-1656.

[10] Box G E P,HunterW G.Statistics for experimerits:an introduction to design[C]//Data analysis odel building.New York:W iley,1990.

[11] 費(fèi)榮昌.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].第4版.無錫:江南大學(xué)教材,2001,59-63.

Opt im ium extraction of polysaccharides from foliumA rtem isia argyiby response surface methodology

SHEN Xia1, ZHANG Yan-hong1, YUAN Hui-hui1, LAN min-bo1,2＊

(1.Analysis and Research Center,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Key Laboratory forUltrafineMaterials of M inistry of Education,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

R284.2

A

1001-1528(2010)01-0048-04

2009-03-13

上海市科委中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)基金(08DZ1974000)

沈 霞(1984-),女,碩士研究生,研究方向:天然藥物活性成分的提取,Tel:(021)64250557 E-mail:030070240@mail.ecust. edu.cn

＊通訊作者:藍(lán)閩波,教授,研究方向:天然產(chǎn)物提取分離及藥物新劑型的研究。Tel:(021)64253574 E-mail:minbolan@ecust.edu.cn