付英杰, 田景振

(山東中醫(yī)藥大學,山東濟南 250355)

阿膠低肽酶解工藝的實驗研究

付英杰, 田景振＊

(山東中醫(yī)藥大學,山東濟南 250355)

阿膠;低肽;酶解工藝

阿膠為馬科動物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。性味甘、平,歸肺肝腎經(jīng),功能補血、止血、滋陰潤燥,主治血虛證,另可作腫瘤的輔助治療[1,2]。

阿膠主含膠原蛋白,但膠原蛋白的消化吸收需要蛋白酶參與降解,而適應癥人群則常見脾胃虛弱或胃腸道反應,服用阿膠不僅會造成患者消化系統(tǒng)的負擔,而且藥效也不能得到充分的發(fā)揮。目前市售阿膠類制劑均以阿膠藥材為原料,無法克服上述缺點。為使阿膠類制劑更好地發(fā)揮療效,并使其酶解工藝可控,筆者擬模仿消化道內(nèi)的條件,以測定的有效低肽含量的得率為指標,優(yōu)化阿膠酶解的最佳工藝。

1 儀器與試劑

SYC-15超級恒溫水浴(南京桑力電子設備廠);LD4-2A低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);PHS-3C精密型pH計(上海三信儀表廠);中空纖維超濾裝置(北京市旭邦膜設備有限責任公司);紫外分光光度計(日立UV-3010)。

阿膠購自濟南建聯(lián)中藥店;胃蛋白酶(Pepsin,BR;活力1:300 0,批號:F20031224,購于中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司);胰蛋白酶(Trypsin,BR;活力1:250 0,批號: F20041022,購于國藥集團化學試劑有限公司);牛血清白蛋白(Albumin,Bovine Biotech,批號:B67328,購于上海生工生物工程有限公司);考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue G-250 Ultra Pure,批號:0241B75,購于上海生工生物工程有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 考馬斯亮藍法測定方法的建立[3]

考馬斯亮藍G-250的最大吸收波長為488 nm,當它與蛋白質(zhì)結合后形成蛋白質(zhì)-色素結合物,在595 nm波長下有最大吸收。其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。該染色過程原理是通過范德華力將染料分子與蛋白質(zhì)或肽分子結合[4],分子量越小,結合力越小。通過預實驗得知,當分子量MW t.<1kD(千道爾頓)時,A595在可允許誤差以內(nèi)。

標準曲線的制備:分別取六只試管,其中一只加入1.0 mL蒸餾水做空白,5只分別加入不同體積的濃度為100μg/mL牛血清白蛋白標準液,補充水到1.0 mL。然后每只試管加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑,搖勻放置5 min,采用玻璃比色皿,在紫外-可見分光光度計595 nm處測定吸光度。以A595為縱坐標,牛血清白蛋白的數(shù)(μg)為橫坐標繪制標準曲線。

樣品溶液的制備與測定:配制濃度約100μg/mL的待測阿膠低肽溶液。取一支試管加入1.0 mL蒸餾水做空白,一支加入0.5 mL待測阿膠低肽溶液,補充水到1.0 mL。然后每支試管加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑,搖勻放置5 min后,用玻璃比色皿在紫外-可見分光光度計595 nm處測定吸光度。用測得的吸光度從標準曲線上查得相當于牛血清白蛋白的數(shù)量(μg),計算出待測低肽的含量。

蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結合在2 min左右的時間內(nèi)達到平衡,其結合物在室溫下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2 影響酶解因素的考察

據(jù)文獻報道[5],一般酶解需要考察的因素有溫度、pH值、加酶量、酶解時間。由于用本工藝提取阿膠有效部位未見報道,故需要通過單因素試驗摸索其提取條件,以確定各因素的水平。本實驗的pH值和溫度分別采用胃蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH值和最適溫度,以便使酶發(fā)揮最大活力,節(jié)省酶的用量。本實驗以模擬人體內(nèi)蛋白水解的過程,采用蛋白酶水解法,分別進行各項單因素考察。在預試驗結果及確定阿膠低肽量效關系的基礎上,以阿膠MW t.(分子量)<3 kD低肽含量的得率為指標,通過考馬斯亮藍法測定結果優(yōu)選最佳酶解工藝,最后進行低肽含量及藥效驗證。

預實驗工藝流程如下(注:為節(jié)省空間,胃蛋白酶簡寫為胃酶,胰蛋白酶簡寫為胰酶):

預實驗結果:確定酶的最適pH為pH2.0和pH8.0;而最適溫度則需要單因素考察。

2.2.1 提取溫度考察 取粉碎的阿膠2.5 g,用20倍水溶解,80℃水浴加熱30 min,冷卻至室溫,調(diào)pH值至2.0,加胃蛋白酶10萬U/g,按表1內(nèi)不同溫度進行考察。根據(jù)預實驗工藝流程配得樣品若干,用考馬斯亮藍法測定MW t.<3 kD低肽含量[6],計算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結果見表1。

表1 溫度單因素考察結果

結果表明,42℃下進行酶解為最佳酶解溫度,故以下單因素考察及正交試驗均以42℃為酶解溫度。

2.2.2 胃蛋白酶酶解時間考察 按2.2.1項下方法進行操作,固定其他各因素,僅胃蛋白酶酶解時間變化,計算MW t. <3 kD阿膠低肽的收率,結果見表2。

表2 胃蛋白酶酶解時間考察結果

2.2.3 胃蛋白酶酶量考察 按2.2.1項下方法進行操作,固定其他各因素,僅胃蛋白酶加入量變化,計算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結果見表3。

表3 胃蛋白酶酶量考察結果

2.2.4 胰蛋白酶酶解時間考察 按2.2.1項下方法進行操作。固定其他各因素,僅胰蛋白酶酶解時間變化,計算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結果見表4。

表4 胰蛋白酶酶解時間考察結果

2.2.5 胰蛋白酶酶量考察 按2.2.1項下方法進行操作。固定其他各因素,僅胰蛋白酶加入量變化,計算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結果見表5。

表5 胰蛋白酶酶量考察結果

2.3 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗的結果,以考馬斯亮藍測得的濃度為指標,考察胃蛋白酶酶解時間、胃蛋白酶酶量、胰蛋白酶酶解時間和胰蛋白酶酶量4個因素對有效成分提取的影響。以L9(34)正交表進行試驗,每次實驗稱取阿膠粉2.5 g,以正交試驗表中各水平按預實驗工藝流程操作,最后配成MW t.<3 kD的阿膠低肽提取液100 mL,計算收率。因素水平見表6,正交試驗及結果見表7,方差分析見表8。

表6 因素水平表

表7 正交試驗及結果

表8 方差分析

以考馬斯亮藍測得的MW t.<3 kD低肽含量為指標,表中的極差R的大小顯示各因素作用主次為:胃蛋白酶酶量>胰蛋白酶酶解時間>胃蛋白酶酶解時間>胰蛋白酶酶量。表中的方差分析表明:胃蛋白酶酶量和胃、胰蛋白酶酶解時間有顯著性意義。從直觀分析得知最佳提取工藝組合為: A2B2C2D2。從實際的生產(chǎn)上考慮,為了節(jié)省蛋白酶的用量,且胰蛋白酶酶量因素在酶解過程中影響小,故采用A2B2C1D2,即胃蛋白酶酶量10萬U/g、胃蛋白酶酶解時間2 h、胰蛋白酶酶量5千U/g、胰蛋白酶酶解時間3 h為最佳提取工藝。

2.4 驗證性試驗

取粉碎的阿膠2.5 g,用20倍水溶解,80℃水浴加熱30 min,冷卻至室溫,加胃蛋白酶10萬U/g,42℃酶解2 h,冷卻至室溫,調(diào)pH值至8.0,加胰蛋白酶5千U/g,酶解3 h。測定MW t.<3 kD低肽含量,進行工藝驗證,結果見表9。

2.5 藥效驗證實驗

取體重(20±2)g的小鼠10只,每天注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg,連續(xù)5 d,造模后24 h將小鼠固定于特制的小鼠固定籠具,尾部用溫水加溫,使小鼠尾部充血,用剪刀剪斷尾尖,取血,檢測Hb、RBC和白細胞數(shù),作為給藥前的血常規(guī)標準。然后于第6天開始每天腹腔注射最佳工藝的MW t.<3 kD的阿膠低肽藥液0.05 mL,于14 d斷尾取血,檢測Hb(血紅蛋白)、RBC(紅細胞)和WBC(白細胞)數(shù),結果見表10。

表9 驗證性試驗結果(n=3)

表10 藥效驗證性實驗結果(n=10)

實驗結果證明:阿膠低肽的量效關系是可靠的。以分子量<3 kD肽的含量為指標,利用正交實驗設計優(yōu)選了阿膠酶的提取工藝,同時進行藥效驗證實驗,兩種方法所得結論一致。證實了用最佳酶解工藝制得的阿膠低肽是有效且穩(wěn)定的。

3 小結與討論

3.1 用考馬斯亮藍法測定多肽含量,是因為制備的肽為通過了超濾而得到的MW t.<3 kD的低肽,且已證實MW t.在1 kD～3 kD為有效分子量范圍,并且小分子量的氨基酸加入考馬斯亮藍不顯色,而MW t.<1 kD的小肽一方面含量低,另一方面由于小肽分子量小,與染料之間的范德華力小,結合力差。實驗證實阿膠低肽酶解液中的MW t.<1 kD的部分在可允許誤差范圍內(nèi)。故用此方法可以很好地測定有效肽的含量,并能表示藥效強弱,在本實驗中亦得到了驗證。

3.2 本實驗得到的最佳酶解工藝:酶解溫度為42℃、胃蛋白酶酶解pH為2.0、胃蛋白酶酶量10萬U/g、胃蛋白酶酶解時間為2 h、胰蛋白酶酶解pH為8.0、胰蛋白酶酶量為5千U/g、胰蛋白酶酶解時間為3 h。

3.3 單因素考察結果較正交試驗結果并不完全對應,可能原因在于單因素實驗采用的蛋白酶酶解時間短(1.5 h),胃蛋白酶與胰蛋白酶酶解時間有交互作用,蛋白酶酶切位點等有關,具體原因有待進一步考察。

3.4 驗證試驗得到的MW t.<3 kD的阿膠低肽收率為22.48%。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),MW t.>3 kD的部分仍有一定量未完全酶解的大分子量蛋白,若將超濾后的濃集液進行二次或多次酶解,可提高MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,但多次酶解需要結合實際生產(chǎn)成本進行計算。

[1] 雷載權.中藥學[M].上海:上?？茖W技術出版社,1995:303.

[2] 魏 東,王 瑛,張 濤,等.大劑量阿膠治療晚期腫瘤化療后血小板減少癥的臨床研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報,2002,25 (1):32.

[3] 汪家政,范 明.蛋白質(zhì)技術手冊[M].北京:科學出版社, 2000:42-47.

[4] 陸 健.蛋白質(zhì)純化技術及應用[M].北京:化學工業(yè)出版社, 2005:173.

[5] 宋煥祿.動物蛋白酶解研究(Ⅱ)[J].食品科學,2001,22(6): 28.

[6] 付英杰,田景振.考馬斯亮藍法對阿膠低肽含量測定的方法學研究[A].中華中醫(yī)藥學會制劑分會第九屆學術研討會論文集[C].長春:中華中醫(yī)藥學會制劑分會,2008:289.

R284.2

B

1001-1528(2010)01-0143-04

2008-11-12

付英杰(1983-),男,博士研究生。研究方向:中藥制劑。Tel:(0531)89628597 E-mail:pilipili@163.com

＊通訊作者:田景振(1957-),教授,博士生導師。Tel:(0531)89628080 E-mail:tianjingzhen@163.com